腺苷后處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌NF-κB和IL-1β的影響

田 金,王 雄

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見(jiàn)的病理生理過(guò)程,其機(jī)制與炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān),尋找能有效減少炎性因子水平的藥物,已成為缺血再灌注藥物研究的重要方面。腺苷作為機(jī)體一種重要的內(nèi)源性活性物質(zhì),其心臟保護(hù)作用成為近幾年研究的熱點(diǎn)[1-3],腺苷預(yù)處理可抑制缺血再灌注后的炎性反應(yīng)[4]。本研究擬進(jìn)一步觀(guān)察在缺血再灌注后給藥對(duì)大鼠心肌細(xì)胞核因子κ B(NF-κ B)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的影響,以明確腺苷后處理是否和缺血預(yù)適應(yīng)同樣具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 雄性清潔級(jí)Wistar大鼠(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重(220～250)g,經(jīng)20%烏拉坦(5 ml/kg)腹腔麻醉,以針形電極插四肢皮下,觀(guān)察記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣。開(kāi)胸暴露心臟,在左冠狀動(dòng)脈前降支距左心耳下緣2 mm處穿過(guò)絲線(xiàn),提起后以套管夾閉造成冠狀動(dòng)脈阻塞。心肌缺血依據(jù)心電圖ST段抬高確認(rèn);再灌注依據(jù)ST段恢復(fù)確認(rèn)。手術(shù)結(jié)束后輸入液體,控制30 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 32只大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只。假手術(shù)組:開(kāi)胸只穿線(xiàn)不結(jié)扎血管,麻醉維持150 min;缺血再灌注組(I/R):結(jié)扎 LAD 30 min,再灌注 120 min;缺血后處理組:缺血30 min,再灌注30 s停止灌注30 s,重復(fù) 3次,再灌注120 min;腺苷組:結(jié)扎 LAD 30 min后,股靜脈緩慢滴注腺苷305 μ g/(kg?min),持續(xù) 5 min,再灌注 120 min。

1.3 光鏡觀(guān)察 各組切取相同部位心尖部心肌組織,光鏡下觀(guān)察心肌結(jié)構(gòu)變化。

1.4 心肌組織NF-κ B的活化及免疫組化檢測(cè) 按非生物素二步法免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)說(shuō)明書(shū)操作,取石蠟切片按程序脫蠟,3%(v/v)H2O2滅活內(nèi)源性酶,微波抗原修復(fù),以 1∶100的兔抗大鼠NF-κ B65多克隆抗體為一抗,山羊抗兔IgG為二抗,加酶標(biāo)記物,DAB顯色,光鏡下觀(guān)察。應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)區(qū)域,計(jì)算每個(gè)區(qū)域中染色部分占整個(gè)區(qū)域面積的百分比,以均值表示每個(gè)心肌中陽(yáng)性信號(hào)面積。

1.5 心肌組織中IL-1β含量的測(cè)定 取0.05 g的心肌組織,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在4℃條件下勻漿,再離心20 min,轉(zhuǎn)速1 200/min,取上清液用于 IL-1β測(cè)定,根據(jù) ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)中提供的步驟操作,測(cè)出IL-1β含量。

2 結(jié) 果

2.1 腺苷對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊,心肌纖維完整,排列整齊,著色均勻,無(wú)變性壞死,間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌纖維著色不均,排列紊亂,部分心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞呈現(xiàn)大片狀壞死,壞死區(qū)域紅染、界線(xiàn)不清,間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。缺血后處理組同腺苷后處理組心肌細(xì)胞排列較I/R組整齊,心肌纖維著色不均,排列紊亂,可見(jiàn)點(diǎn)灶狀壞死,壞死范圍比I/R組小,間質(zhì)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 腺苷對(duì)心肌NF-κ B表達(dá)的影響 假手術(shù)組NF-κ B的表達(dá)面積較小。I/R組NF-κ B的表達(dá)面積大,范圍廣,并可見(jiàn)有細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),說(shuō)明有部分NF-κ B在活化過(guò)程中轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。缺血后處理及腺苷后處理組的NF-κ B表達(dá)的陽(yáng)性面積均明顯小于I/R組,且其陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度也要弱于I/R組(P＜0.01);而缺血后處理及腺苷后處理組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)明顯差異;I/R組、缺血后處理組及腺苷后理組明顯大于假手術(shù)組(P＜0.01)。詳見(jiàn)表1。

2.3 腺苷對(duì)心肌IL-1β含量的影響 缺血后處理組與腺苷后理組大鼠心肌IL-1β水平較I/R組明顯下降(P＜0.01);而腺苷處理組與缺血后處理組心肌中IL-1β水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);I/R組、缺血后處理組及腺苷后理組較假手術(shù)組心肌IL-1β水平明顯升高(P＜0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠心肌組織NF-κ B面積和IL-1β含量比較(±s)

表1 大鼠心肌組織NF-κ B面積和IL-1β含量比較(±s)

組別 鼠數(shù)(只)NF-κ B面積(%) IL-1β(pg/g)假手術(shù)組 8 9.98±5.01 22.36±3.2 I/R組 8 51.55±8.651) 60.25±5.081)缺血后處理組 8 33.40±4.691)2) 39.70±4.971)2)腺苷后處理組 8 31.63±5.431)2) 38.87±5.311)2)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與I/R組比較,2)P＜0.01

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與諸多因素有關(guān),如氧自由基(OFR)的作用、鈣超載、內(nèi)皮細(xì)胞的激活,炎癥反應(yīng)的作用,細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)[5]和NF-κ B[6]等在心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生中皆起著非常重要的作用。腺苷是目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中都證實(shí)對(duì)缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用的藥物[7]。腺苷作為機(jī)體一種重要的內(nèi)源性活性物質(zhì),可觸發(fā)和介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng),減輕缺血再灌注損傷,減少無(wú)復(fù)流現(xiàn)象,從而起到心肌保護(hù)作用。很多研究表明腺苷A2a受體產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)來(lái)抑制炎癥反應(yīng),減少單核細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子[8],降低血小板活性[9],而且抑制淋巴細(xì)胞活性[10]。本研究顯示,腺苷后處理對(duì)缺血再灌注心臟起保護(hù)作用,病理?yè)p傷減輕,NF-κ B的表達(dá)下降以及炎性細(xì)胞因子IL-1β的分泌降低。

NF-κ B是一個(gè)廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化與凋亡及其他應(yīng)激反應(yīng)[11]。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí),NF-κ B與它抑制因子 Iκ B結(jié)合在一起,以無(wú)活性的同源或異源二聚體形式存在于多種組織的細(xì)胞質(zhì)中。NF-κ B在心肌I/R損傷中發(fā)揮著重要作用,其在缺血、再灌注、氧自由基、白介素等刺激下而激活[12,13],通過(guò)一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起活化,活化的NF-κ B從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核,與靶基因的κ B位點(diǎn)結(jié)合而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子增加[14],加重組織器官功能的損傷,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織在缺血再灌注后,NF-κ B活性明顯增加,IL-1β表達(dá)增強(qiáng),可證明心肌缺血再灌注確實(shí)有炎性反應(yīng)存在;而給予腺苷后處理后,NF-κ B活化被明顯抑制,同時(shí),IL-1β的表達(dá)也顯著減少,說(shuō)明腺苷后處理可以抑制NF-κ B的激活,降低炎性細(xì)胞因子 IL-1β的表達(dá),從而減輕心臟的炎性反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示,腺苷后處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌具有保護(hù)作用,其部分保護(hù)作用機(jī)制可能與腺苷后處理抑制NF-κ B活化,從而減少I(mǎi)L-1β的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。具體中間機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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