樓丹飛,曹 敏,王佑華,周 端
冠心病是動(dòng)脈粥樣硬化病變使冠狀動(dòng)脈狹窄、閉塞,影響冠狀循環(huán)血流,引起心肌缺血的一種心臟病。冠心病的發(fā)病率已躍居心臟病首位,嚴(yán)重危害人們的身心健康,防治冠心病已成為各國(guó)不容忽視的嚴(yán)峻課題。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院周端教授臨床采用益氣活血通痹法治療冠心病心絞痛收到較好效果,此后根據(jù)益氣活血通痹法自擬了小復(fù)方(生曬參、三七、麝香),并在前期實(shí)驗(yàn)研究中觀察益氣活血通痹小復(fù)方不同粒徑制劑的體外溶出度情況[1,2]。本文在前期研究基礎(chǔ)上,觀察了益氣活血通痹小復(fù)方對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響,以進(jìn)一步探討該方作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) SD大鼠,體重200 g~250 g,共63只,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2003~ 0003。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 益氣活血通痹小復(fù)方:由生曬參(上海萬(wàn)仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司,吉林,批號(hào):070115)1.5 g,三七(上海萬(wàn)仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司,云南,批號(hào):070104)1.5 g,麝香(中國(guó)阿壩洲醫(yī)藥公司總經(jīng)銷,四川,批號(hào):20070628)0.1 g組成,由上海超微科技有限公司用超微6 L粉碎機(jī)粉碎成粗粉(24目~65目/250 μ m ~ 850 μ m)、中粉(65 目 ~ 100 目/150 μ m ~ 250 μ m),超微細(xì)粉(625目/20 μ m)。粗粉組、中粉組、超微細(xì)粉組,雙蒸水溶解,制備成每毫升含 37.7 mg/mL的藥液。煎劑組,每毫升含生藥量37.7 mg/mL。麝香保心丸(上海和黃藥業(yè)有限公司,上海,批號(hào):A070402)研磨成粉,雙蒸水溶解,制備成每毫升含1.65 mg/mL麝香保心丸的藥液。
1.1.3 主要儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)ALC-V8(上海奧爾柯特生物技術(shù)有限公司);Powerlab8/30生理記錄儀(AD Instrument,澳大利亞);T P1020型組織自動(dòng)脫水機(jī),EG1160型全自動(dòng)石蠟包埋機(jī),RM2235切片機(jī),Histobath型HI1210展攤片機(jī),HistoplateHI1220型烘片機(jī)(EICA,德國(guó));DHG-9140A電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);MV-CP410型攝像機(jī)(Panasonic,日本);CX31型顯微鏡,BH2型熒光倒置顯微鏡(Olympus,日本)。
1.1.4 主要試劑 Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液:其組成成分為:NaCl 118.0 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,M gSO4?7H2O 1.2 mmol/L,NaHCO325.0 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,以雙蒸水溶解,最后加入 CaCl22.5 mmol/L。溶液以95%O2+5%CO2的混合氣體預(yù)充20 min以上,灌流液pH 7.35~7.45。
1.2 分組與給藥 共分7組,每組大鼠9只。假手術(shù)組、模型組予生理鹽水2 mL/d灌胃;粗粉組予粗粉136.8 mg/(kg?d);中粉組予中粉136.8 mg/(kg?d);超微細(xì)粉組予超微細(xì)粉136.8 mg/(kg?d);煎劑組予煎劑136.8mg/(kg?d);麝香保心丸組予麝香保心丸12.3 mg/(kg?d)。每天灌胃,連續(xù)14 d。
1.3 造模方法 最后1 d灌胃30 min后,除假手術(shù)組外各組均行冠脈結(jié)扎。方法參考文獻(xiàn)[3,4]稍作改動(dòng),具體步驟:用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)行腹腔注射麻醉大鼠,麻醉滿意后固定于鼠板上,用18號(hào)靜脈留置針行氣管插管,連接動(dòng)物呼吸機(jī)行人工呼吸(呼吸比為 1∶2,潮氣量20 mL/min~22 mL/min)。四肢皮下連接心電圖電極,記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。胸骨左側(cè)剃毛,于劍突上1.0 cm,旁開約0.5 cm切開皮膚,逐層鈍性分離皮下組織、肌肉,剪斷第三根肋骨,用開瞼器撐開胸腔,剝離心包膜暴露心臟,在動(dòng)脈圓錐和左心耳之間,左心耳下方約1 mm~2 mm,用0/5號(hào)帶線縫合針,進(jìn)針深度控制在0.1 cm左右,寬度為0.1 cm~0.2 cm之間結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,結(jié)扎處放一長(zhǎng)約0.5 cm、直徑為1.5 mm軟棉線,用絲線活結(jié)結(jié)扎。結(jié)扎后迅速清除胸腔內(nèi)多余血液,觀察心電圖變化,以心電圖J點(diǎn)明顯抬高(>0.1 mV)并穩(wěn)定10 min以上,心尖部心肌呈灰白色為模型制備成功標(biāo)志。假手術(shù)組用同樣大小的帶線縫合針從左心耳下緣右側(cè)進(jìn)針,從肺動(dòng)脈圓錐左側(cè)出針,進(jìn)針深度及寬度同上,但縫合針不打結(jié)。其余操作同上。各組冠狀動(dòng)脈結(jié)扎60 min后,腹主動(dòng)脈取血,迅速開胸取出心臟,置入4℃含95%O2、5%CO2飽和K-H液中,輕輕擠壓心臟排出心臟內(nèi)殘血,修剪出主動(dòng)脈端口,將離體心臟固定到 Langendorff裝置上,恒溫(37℃),恒壓(80 cmH2O柱)K-H液灌流,持續(xù)通入 95%O2~5%CO2氣體。用鉤針挑松結(jié)扎絲線,再灌注120 min。從左心耳插入帶球囊的導(dǎo)管至左心室,經(jīng)壓力換能器連接到Powerlab生理記錄儀上。將灌流完畢的心臟取下,用濾紙吸去心臟多余的灌流液,剪去心房、結(jié)締組織、大血管和心包組織,沿室間隔分離左心室(包括室間隔)和右心室,棄右心室,左心室以冰生理鹽水沖洗干凈,部分置中性甲醛溶液中固定,剩余部分立即保存在-70℃冰箱中。
1.4 主要觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法
1.4.1 血流動(dòng)力學(xué) 將帶有球囊的導(dǎo)管從左心耳插入至左心室,經(jīng)壓力換能器連接到Powerlab生理記錄儀上連續(xù)記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。
1.4.2 冠脈流量(coronary flow,CF) 收集平衡后10 min、30 min、60 min、90 min、120 min 五個(gè)時(shí)間點(diǎn) 1 min內(nèi)的冠脈漏出液,使用量筒測(cè)量各組1 min內(nèi)冠脈流量。
1.4.3 心肌HE染色 大鼠在心臟灌流120 min后,摘取心臟,取結(jié)扎點(diǎn)以下5 mm處心肌組織周徑容積,中性甲醛溶液固定心臟,按常規(guī)石蠟包埋后,每個(gè)組織塊做切片(厚度4 μ m),行蘇木素-伊紅(HE)染色。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。符合正態(tài)分布的多組樣本間比較采用oneway ANOVA檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的均數(shù)比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組血流動(dòng)力學(xué)變化
2.1.1 左室收縮壓 在各時(shí)間段,模型組與假手術(shù)組比較LVSP降低明顯(P<0.01)。與模型組同時(shí)間點(diǎn)相比,各治療組均能改善LVSP的降低(P<0.05或 P<0.01)。灌流 30 min、90min、120min時(shí),中粉組、超微細(xì)粉組優(yōu)于麝香保心丸組(P<0.05);灌流10min時(shí),超微細(xì)粉組優(yōu)于麝香保心丸組(P<0.05)。在各時(shí)間點(diǎn),超微細(xì)粉組優(yōu)于粗粉組(P<0.05),在灌流90min時(shí),中粉組優(yōu)于粗粉組(P<0.05)。與煎劑組相比較,灌流30 min時(shí),中粉組優(yōu)于煎劑組(P<0.05);灌流10 min、30 min、120 min時(shí),超微細(xì)粉組優(yōu)于煎劑組(P<0.05)。中粉組和超微細(xì)粉組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。
表1 各組左室收縮壓的變化(±s)mmHg
表1 各組左室收縮壓的變化(±s)mmHg
組別 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手術(shù)組 9 85.98±15.18 79.80±15.91 73.56±14.02 71.80±15.06 74.37±15.92模型組 8 42.04±16.081) 42.77±13.491) 41.87±15.541) 43.52±16.901) 43.91±14.891)粗粉組 7 52.37±21.311)2) 54.66±14.311)2) 51.97±17.061)2) 51.62±20.661)2) 52.23±18.801)2)中粉組 8 59.84±18.351)3) 61.71±18.861)3)4)6) 59.15±20.471)3) 59.53±20.551)3)4)5) 57.75±19.111)3)4)超微細(xì)粉組 8 61.74±13.401)3)4)5)6) 62.71±15.511)3)4)5)6) 60.08±11.481)3)5) 59.39±11.111)3)4)5) 59.04±10.951)3)4)5)6)煎劑組 8 53.03±22.221)3) 51.69±16.621)2) 54.71±15.991)3) 54.14±18.821)3) 51.54±17.331)2)麝香保心丸組 7 58.88±22.321)2) 52.92±12.411)2) 57.03±9.341)3) 56.37±13.481)2) 49.33±13.131)2)與假手術(shù)組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01;與麝香保心丸組比較,4)P<0.05;與粗粉組比較,5)P<0.05;與煎劑組比較,6)P<0.05
2.1.2 左室舒張末壓 與假手術(shù)組比較,在各時(shí)間點(diǎn),模型組LVEDP升高明顯(P<0.01)。與模型組相比,在各時(shí)間點(diǎn),中粉組、超微細(xì)粉組、麝香保心丸組能改善LVEDP的抬高(P<0.05或 P<0.01);灌流 90 min、120 min時(shí),粗粉組優(yōu)于模型組(P<0.05或 P<0.01)。與粗粉組相比較,在灌流 10 min時(shí),中粉組、超微細(xì)粉組優(yōu)于粗粉組(P<0.01);在灌流30 min時(shí),超微細(xì)粉組優(yōu)于粗粉組(P<0.05)。與煎劑組比較,在各時(shí)間點(diǎn),中粉組、超微細(xì)粉組優(yōu)于煎劑組(P<0.05或 P<0.01);在灌流120 min時(shí),粗粉組、麝香保心丸組優(yōu)于煎劑組(P<0.01)。中粉組和超微細(xì)粉組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。
表2 各組左室舒張末壓的變化(±s) mmHg
表2 各組左室舒張末壓的變化(±s) mmHg
組別 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手術(shù)組 9 3.93±2.87 3.90±2.99 6.06±3.59 6.31±3.81 6.45±3.41模型組 8 9.78±2.612) 10.28±2.782) 11.56±3.642) 12.80±4.012) 12.21±3.982)粗粉組 7 9.92±5.272) 8.75±4.042) 9.72±4.891) 9.11±4.673) 7.59±4.354)8)中粉組 8 6.17±4.354)6)8) 6.64±4.271)4)7) 6.90±4.764)8) 7.07±5.214)7) 7.43±4.634)8)超微細(xì)粉組 8 5.74±3.354)6)8) 5.49±4.054)5)7) 7.27±6.214)8) 7.15±6.144)7) 6.08±6.384)8)煎劑組 8 9.60±2.981) 10.10±3.062) 11.40±3.682) 11.12±3.402) 11.25±3.092)麝香保心丸組 7 6.66±2.551)3) 7.04±3.102)4) 7.85±3.273) 8.97±5.343) 6.78±4.012)4)8)與假手術(shù)組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01;與粗粉組比較,5)P<0.05,6)P<0.01;與煎劑組比較,7)P<0.05,8)P<0.01
2.1.3 左心室內(nèi)壓最大上升速率 在各時(shí)間段,與假手術(shù)組比較,模型組+dp/dtmax下降明顯(P<0.01)。與模型組比較,麝香保心丸組、益氣活血通痹小復(fù)方各組在各時(shí)間點(diǎn)均能顯著改善+dp/dtmax的變化(P<0.01),但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在灌注30 min時(shí),超微細(xì)粉組優(yōu)于煎劑組(P<0.01)。詳見表3。
表3 各組左心室內(nèi)壓最大上升速率的變化(±s)
表3 各組左心室內(nèi)壓最大上升速率的變化(±s)
組別 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手術(shù)組 9 2 396±457 2 291±410 2084±362 2 012±376 1 991±375模型組 8 1 136±3581) 1 164±3421) 1 159±4331) 1 163±4301) 1 145±4311)粗粉組 7 1 579±4061)2) 1 643±2991)2) 1 684±2011)2) 1 619±2991)2) 1 627±3141)2)中粉組 8 1 666±3731)2) 1 813±2631)2) 1 678±3711)2) 1 644±2201)2) 1 730±2091)2)超微細(xì)粉組 8 1 791±4811)2) 1 797±4261)2)3) 1 630±2781)2) 1 615±3001)2) 1 586±2811)2)煎劑組 8 1 565±4801)2) 1 895±3701)2) 1 733±4511)2) 1 670±4991)2) 1 697±4241)2)麝香保心丸組 7 1 660±4711)2) 1 759±4541)2) 1 554±4041)2) 1 574±4051)2) 1 556±4051)2)與假手術(shù)組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.01;與煎劑組比較,3)P<0.01
2.1.4 左心室內(nèi)壓最大下降速率 在各時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組比較,模型組-dp/dtmax下降明顯(P<0.01)。與模型組比較,在灌流30 min時(shí),中粉組、超微細(xì)粉組、煎劑組、麝香保心丸組對(duì)此有一定的改善作用(P<0.05或P<0.01);在灌流60 min時(shí),中粉組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);麝香保心丸組與各益氣活血通痹小復(fù)方組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);益氣活血通痹小復(fù)方各組間比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。
表4 各組左心室內(nèi)壓最大下降速率的變化(±s)
表4 各組左心室內(nèi)壓最大下降速率的變化(±s)
組別 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手術(shù)組 9 -1 877±353 -1 762±330 -1 581±306 -1 477±259 -1 497±206模型組 8 -992±2911) -953±2461) -882±2271) -897±2671) -914±2881)粗粉組 7 -1 180±4731) -1 120±2071) -1 101±1951) -1 075±2471) -1 102±2941)中粉組 8 -1 075±3761) -1 259±2321)3) -1 128±2551)3) -1 075±2871) -1 086±2111)超微細(xì)粉組 8 -1 147±3461) -1 223±3051)3) -1 082±3771) -1 037±2571) -1 118±2411)煎劑組 8 -1 227±3911) -1 181±2831)2) -1 066±1721) -1 056±2451) -1 037±1941)麝香保心丸組 7 -1 197±3631) -1 198±3421)2) -1 057±3521) -1 057±3981) -1 041±3611)與假手術(shù)組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01
2.2 各組CF的變化 在各時(shí)間點(diǎn),模型組冠脈流量減少明顯,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在各時(shí)間點(diǎn),超微細(xì)粉組與模型組比較,能顯著改善冠脈流量的減少(P<0.05或P<0.01)。中粉組在除灌流10 min外其他各時(shí)間與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。麝香保心丸組與益氣活血通痹小復(fù)方各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。益氣活血通痹小復(fù)方各組間比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。
表5 各組冠脈流量的變化(±s)mL
表5 各組冠脈流量的變化(±s)mL
組別 n 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min假手術(shù)組 9 11.18±2.28 11.22±2.24 11.16±1.97 11.38±1.81 10.58±1.80模型組 8 6.12±2.651) 6.00±2.711) 5.60±2.751) 4.90±2.901) 4.72±2.531)粗粉組 7 7.82±2.701) 7.66±2.541) 7.16±2.471) 7.14±2.191) 6.72±1.971)中粉組 8 7.24±2.371) 8.36±2.291)2) 7.94±2.351)2) 7.58±2.421)3) 7.06±2.241)3)超微細(xì)粉組 8 8.84±2.861)2) 8.74±2.761)3) 8.38±3.221)3) 8.10±3.071)3) 7.76±2.931)3)煎劑組 8 7.48±2.331) 7.44±2.181) 7.84±2.531) 6.76±2.671) 6.62±2.621)麝香保心丸組 7 8.08±3.121) 7.73±3.271) 7.42±2.861) 6.76±2.411) 6.55±2.281)與假手術(shù)組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01
2.3 心肌HE染色 光鏡下觀察可見:假手術(shù)組心肌組織未見充血、出血或炎細(xì)胞反應(yīng),心肌細(xì)胞排列整齊,核大,染色較淡。模型組各例均有不同程度因缺血而引起的心肌損害,主要表現(xiàn)為心肌纖維變長(zhǎng),排列紊亂而疏松,呈波浪形,肌纖維間距增寬,間質(zhì)輕度水腫,充血或出血,少許炎細(xì)胞反應(yīng),并出現(xiàn)局灶性壞死。治療組心肌細(xì)胞的損傷程度較輕,主要表現(xiàn)為肌纖維排列呈波浪形,細(xì)胞腫脹,偶見少量淤血,但未見肌纖維變形斷裂。其中,超微細(xì)粉組損傷最輕,僅見小部分細(xì)胞水腫。
近年隨著介入性心臟學(xué)、冠脈內(nèi)球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)、冠脈內(nèi)溶栓、激光汽化等冠脈血管再通和再造術(shù)的完善,使冠脈血栓和嚴(yán)重狹窄的心肌缺血重新恢復(fù)了血液供應(yīng),心肌的再灌注損傷也越來(lái)越受到人們的重視,揭示心肌缺血與再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制,己經(jīng)成為現(xiàn)代心血管疾病防治中的關(guān)鍵課題之一。
心肌缺血時(shí)由于代謝障礙致ATP減少,細(xì)胞內(nèi)K+丟失,無(wú)機(jī)磷酸鹽增多,細(xì)胞內(nèi)酸中毒,引起心肌的興奮-收縮耦聯(lián)障礙,心肌收縮力減弱[5],所以心肌缺血往往伴隨血流動(dòng)力學(xué)及心臟功能的改變。影響心功能的主要因素包括心肌收縮功能、心率和前后負(fù)荷。其中,心肌收縮功能是決定心功能的內(nèi)在因素。在血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)中,+dp/dtmax間接地反映了心肌纖維收縮成分的縮短速度,對(duì)變力性干預(yù)較敏感,具有較大的實(shí)用價(jià)值,是反映心肌收縮功能的較好的指標(biāo)。LVSP升高在一定程度上反映了心肌收縮力的增加[6]。-dp/dtmax反映了心室舒張時(shí)心肌纖維伸長(zhǎng)的最大速度,是衡量左心室舒張期順應(yīng)性及心肌僵硬度的重要指標(biāo)之一,可間接反映左心的舒張功能。LVEDP升高除表示心臟前負(fù)荷增加外,也間接反映心肌的舒張順應(yīng)性??偟膩?lái)說(shuō),LVSP、+dp/dtmax反映左室收縮功能,LVEDP、-dp/dtmax反映左室舒張功能[7]。
心肌缺血時(shí),鈣超載、能量代謝障礙、自由基的大量產(chǎn)生及乳酸和H+等酸性產(chǎn)物的堆集均可引起細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受損,使缺血細(xì)胞發(fā)生病理形態(tài)學(xué)改變[8]。
上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院周端教授在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中認(rèn)識(shí)到,疾病發(fā)生的根本原因在于陰陽(yáng)失調(diào),療疾病的目的就是“謹(jǐn)察陰陽(yáng)所在而調(diào)之,以平為期”。認(rèn)為冠心病屬中醫(yī)胸痹范疇,證屬本虛標(biāo)實(shí),氣虛血瘀是冠心病發(fā)病的病理基礎(chǔ),故治療以益氣活血通痹為主要治法,生曬參、三七、麝香此三藥是導(dǎo)師根據(jù)主要治則及多年臨床經(jīng)驗(yàn)優(yōu)選出來(lái)的三味藥,生曬參為君,大補(bǔ)元?dú)?廣益五臟,針對(duì)氣虛的主要病機(jī);三七為臣,活血通絡(luò),止血消瘀,消腫止痛,兩藥相合,氣行則血行,血行則氣實(shí);麝香為佐,辛香走竄,開竅通絡(luò),宣痹止痛,引藥直達(dá)病所。三者配伍,共奏益氣活血,通痹止痛之功。三藥藥少精當(dāng),配伍合理,切中病機(jī)。
前期研究[1,2]提示:三七和人參及其復(fù)方制劑微粉中的三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的體外溶出速度和溶出量不比常規(guī)機(jī)械粉碎的粉末有優(yōu)勢(shì)。在不同目數(shù)的粉末中,中粉(65目~100目)指標(biāo)成分的溶出速度和累計(jì)溶出量較其他目數(shù)更好。因此本實(shí)驗(yàn)保留了中粉組與超微細(xì)粉組作對(duì)照。本研究發(fā)現(xiàn):通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察表明,缺血 60 min,再灌120 min存在明顯的心肌缺血/再灌注損傷,益氣活血通痹小復(fù)方可減輕心肌缺血的病理性損傷程度。益氣活血通痹小復(fù)方能夠改善缺血心肌收縮功能(LVSP、+dp/dtmax),以中粉、超微細(xì)粉效果最佳。
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