用阻抗法快速測(cè)定巴氏奶中菌落總數(shù)

谷福

0 前言

目前我國(guó)進(jìn)行食品質(zhì)量安全準(zhǔn)入制度（QS），菌落總數(shù)作為巴氏奶的出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目是判定食品被微生物污染程度的重要指標(biāo)之一，按國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2進(jìn)行檢測(cè)，菌落總數(shù)的結(jié)果的報(bào)出需要48h，但是巴氏奶的保質(zhì)期只有3d。為了延長(zhǎng)巴士奶的貨架期，減少檢驗(yàn)的時(shí)間，有必要為尋求一種快速、有效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法,本文用BacTrac4300“微生物定量分析儀”,對(duì)巴氏奶中菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，用阻抗法代替GB/T 4789.2測(cè)定巴氏奶的菌落總數(shù)作為出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目是可行的，需要實(shí)驗(yàn)時(shí)間約4h～6h，具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

1 阻抗法實(shí)驗(yàn)原理

阻抗法是通過(guò)測(cè)量微生物代謝引起的培養(yǎng)基電特性變化來(lái)測(cè)定樣品微生物含量的一種快速檢測(cè)方法。微生物在培養(yǎng)過(guò)程中,生理代謝作用使培養(yǎng)基中的物質(zhì)（如碳水化合物、類(lèi)脂、蛋白質(zhì)）等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醋酸鹽、乳酸鹽或氨鹽等小分子物質(zhì)電活性物質(zhì)。研究表明，隨著微生物增長(zhǎng),培養(yǎng)基中電活性分子和離子增多，使導(dǎo)電性增強(qiáng),電阻抗降低。電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)與微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似,出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)期、加速增長(zhǎng)期、指數(shù)增長(zhǎng)期和緩慢減少期,最后趨于穩(wěn)定期。微生物的起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期的時(shí)間也不同,通過(guò)建立二者之間的關(guān)系,就能通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基電特性變化推算出微生物的起始菌量。將培養(yǎng)基阻抗變化的相對(duì)值定義為 M值，M=（R0-RT）/R0×100%,其中，R0 表示測(cè)量開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基的阻抗值，RT表示測(cè)量開(kāi)始后任意時(shí)刻培養(yǎng)基的阻抗值，M值最終表示了培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小微生物越多。因此測(cè)定M值的變化，即可檢出微生物的數(shù)量。為描述因微生物的顯著生長(zhǎng)而引起培養(yǎng)基阻抗的下降，需要設(shè)定一個(gè)M值的閾值，從測(cè)量開(kāi)始到該微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)達(dá)到設(shè)定的閾值所需的時(shí)間就是阻抗檢測(cè)時(shí)間（IDT）。微生物的起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期的時(shí)間也不同,在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位（CFU）的對(duì)數(shù)Log（CFU）與IDT呈直線(xiàn)關(guān)系，通過(guò)測(cè)定同類(lèi)樣品的一系列CFU（平板計(jì)算法）和相對(duì)應(yīng)的IDT，即可制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)建立二者之間的關(guān)系,就能通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基電性變化推出微生物的原始菌量。對(duì)于未知樣品，只要檢測(cè)其IDT，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，就可以得到CFU值。

本研究用我實(shí)驗(yàn)室已制成巴士奶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別用儀器法和國(guó)標(biāo)法測(cè)樣品的菌落總數(shù)并將結(jié)果進(jìn)行了比較。

2 材料和方法

2.1 儀器和試劑

（1）BacTrac4300微生物定量分析儀,檢測(cè)菌落總數(shù)培養(yǎng)基BiMedia002A由SY-LAB提供。

（2）平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（GB/T 4789.2-2008），廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司。

2.2 檢測(cè)樣品

市售的巴士奶10個(gè)批次。

2.3 平板計(jì)數(shù)法

按國(guó)標(biāo)GB/T 4789.2-2008操作，加入1∶10樣品稀釋液，36±1℃培養(yǎng) 48h。

2.4 阻抗測(cè)定法

每個(gè)測(cè)定瓶加入9mlBiMedia002A培養(yǎng)基，高壓滅菌，測(cè)定前將測(cè)定瓶置于36℃，10個(gè)巴氏奶樣品，共用20個(gè)測(cè)定瓶，取1mL樣品，樣品按GB/T 4789.2-2008進(jìn)行做10-1、10-2、10-3等稀釋,各取1ml樣品稀釋液加入1個(gè)測(cè)定瓶,然后放入BacTrac4300。記錄結(jié)果由計(jì)算機(jī)輸出。儀器設(shè)置：溫度:30℃，最大反應(yīng)時(shí)限：24h，測(cè)量間隔:5min，M-value 的閾值:5%，輸入樣品標(biāo)記，有計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制測(cè)量模式。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

對(duì)同一樣品，用平板法和阻抗法同時(shí)進(jìn)行樣品測(cè)定。當(dāng)Bactrac的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，測(cè)定結(jié)束，儀器將自動(dòng)記錄的數(shù)據(jù)為阻抗檢測(cè)時(shí)間（IDT）。將平板計(jì)數(shù)所得數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的IDT值輸入計(jì)算機(jī)，Bactrac即以IDT為橫坐標(biāo)，以log（CFU）為縱坐標(biāo)，用直線(xiàn)回歸法作二者相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.6 樣品的檢測(cè)

對(duì)于每個(gè)廠家的產(chǎn)品都做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，把樣品1∶10稀釋后接種檢測(cè)瓶，選定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即開(kāi)始檢測(cè)。測(cè)試結(jié)束后，Bactrac根據(jù)該樣品的IDT值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上自動(dòng)計(jì)算出CFU。

3 結(jié)果判斷

（1）按國(guó)標(biāo)GB5408.1,巴氏奶菌落總數(shù)≤30000CFU/ml為合格。

（2）儀器法：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室做的二條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),消毒牛乳為DT≥3.0h為合格。

4 結(jié)果討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1，表2）表明，巴氏奶的兩種檢測(cè)方法在合格率和數(shù)值無(wú)顯著性差異（p＞0.05），這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較：①儀器法利用電阻抗可測(cè)試菌落總數(shù)，具有時(shí)間短的特點(diǎn)，國(guó)標(biāo)法耗時(shí)，需2d，而電阻法可在短時(shí)間內(nèi)（4h～6h）檢測(cè)大量樣品，如樣品菌含量越多，出結(jié)果越更快。②儀器法簡(jiǎn)單、方便，巴氏奶樣品可直接進(jìn)行檢測(cè)或某些巴士奶的樣品如果含有高的鹽分。這些鹽離子使培養(yǎng)基本身帶有很強(qiáng)的導(dǎo)電性，掩蓋了微生物代謝產(chǎn)生的阻抗變化，需要進(jìn)行稀釋后再測(cè)。③儀器法由計(jì)算機(jī)控制檢測(cè)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)記錄，自動(dòng)分析、儲(chǔ)存，圖表、數(shù)據(jù)一目了然，操作者的誤差機(jī)會(huì)較少。④儀器法的缺點(diǎn)是必須先做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)才能使用，測(cè)定用的試劑價(jià)格較貴。⑤通過(guò)電子測(cè)量技術(shù)，一旦微生物數(shù)量增殖達(dá)到106CFU/ml～107CFU/ml時(shí)，即可檢測(cè)信號(hào)的變化，這與平板法的108CFU/ml～109CFU才能形成一個(gè)可視菌落相比，檢測(cè)靈敏度比平板法高出近1000倍。

表1 新老標(biāo)準(zhǔn)胎套色牢度指標(biāo)比較 （單位為級(jí)）

表2 新老標(biāo)準(zhǔn)胎套色牢度指標(biāo)比較 （單位為級(jí)）

綜上所述，儀器法檢測(cè)巴氏奶的菌落總數(shù)的是可行的，檢測(cè)結(jié)果和國(guó)標(biāo)法做出的結(jié)果無(wú)顯著差異，對(duì)巴氏奶食品企業(yè)的質(zhì)量控制，食品衛(wèi)生監(jiān)督、檢測(cè)提供了一條快速、準(zhǔn)確的新途徑。

[1]顧其芳等.測(cè)定食品中的細(xì)菌總數(shù)的探索 [J].中國(guó)公共衛(wèi)生，1998：14（12）745-746.