核酸適體電化學(xué)傳感器研究的新進展

黃田貞，林馨馨，陳媛媛，宦雙燕*

（1.湖南博云東方粉末冶金有限公司，湖南長沙410295）

（2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，湖南長沙410082)

0 引言

核酸適體是一種能夠與蛋白質(zhì)、小分子、離子、核酸、甚至整個細胞等目標分子結(jié)合的人工合成寡聚核苷酸或肽分子。自從90年代Joyce,Gold和Szostak三個獨立的研究小組做出了開創(chuàng)性工作之后[1～3]，核酸適體的研究工作得到了快速發(fā)展。經(jīng)過體外選擇和擴增技術(shù)，從隨機寡核酸文庫中篩選出能與各種配體特異性結(jié)合的寡聚核苷酸片段，Gold小組把這種組合化學(xué)選擇技術(shù)稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)[3]。關(guān)于指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)的詳細進程已經(jīng)有許多報道，在此不做詳細介紹。

盡管關(guān)于核酸適體的研究目前還處于起始階段，但作為生物傳感器設(shè)計的傳感元件方面，與抗體相比，核酸適體具有一定的優(yōu)勢[4～6]。第一，高親和力。據(jù)報道，一些核酸適體與目標蛋白的親和力（解離常數(shù)在皮摩到納摩之間），可與單克隆抗體相媲美或比其更好?？赏ㄟ^提高篩選技術(shù)來提高親和力、穩(wěn)定性和結(jié)合特異性。一旦識別出寡核苷酸序列就可合成高純度的核酸適體。第二，由于核酸適體的合成沒有涉及到動物宿主，所以那些沒有引發(fā)最小觸發(fā)免疫反應(yīng)的分子可以用來合成高親和力的核酸適體。因此核酸適體的一個顯著特征就是目標分子范圍廣。不僅寡核酸、蛋白質(zhì)、酶和抗體可以用來制備核酸適體，一些輔基（磷酸腺苷，黃素單核苷酸等）、有機小分子（染料，藥物，生長因子，氨基酸，肽，糖類等）、甚至是整個細胞、孢子和毒素也可用于核酸適體的合成。如果寡核苷酸庫足夠大，通過SELEX技術(shù)理論上可以篩選出針對任何目標物的核酸適體。第三，可以對核酸適體鏈在精確位點上進行官能團的修飾達到固定化的目的，而不影響其親和力。另外，具有高穩(wěn)定性。核酸適體可以進行不破壞其結(jié)構(gòu)的可逆變性，而且在長期貯存和常溫運輸過程中也穩(wěn)定。與抗體不同，核酸適體能夠耐受非生理狀態(tài)的pH值、溫度和離子強度。此外，由于其小尺寸和低空間位阻，核酸適體在高密度微陣列傳感器方面的應(yīng)用優(yōu)于抗體。

核酸適體可形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聯(lián)體等結(jié)構(gòu)。分子識別時，在目標分析物誘導(dǎo)下單鏈核酸適體會折疊成特殊的二級結(jié)構(gòu)。分子識別的主要相互作用力是氫鍵、疏水作用和范德華力等[7～8]。這種適配識別稱為適應(yīng)性鍵合作用。核酸適體的出現(xiàn)為生物分析方法和傳感器的設(shè)計開辟了新的思路。研究者們已經(jīng)成功地創(chuàng)建了大量基于核酸適體的分析新方法，包括比色法，壓電，表面等離子體共振（SPR），熒光，電化學(xué)原理等。該文重點介紹基于核酸適體電化學(xué)傳感器的最新研究進展。

電化學(xué)傳感器是應(yīng)用最廣泛和最古老的傳感器類型之一，具有成本低、快速檢測、靈敏度高、便攜、操作方便、靈活、能獨立運行、能自動和實時監(jiān)測等顯著優(yōu)點。將核酸適體識別元件與各種電化學(xué)轉(zhuǎn)換器相結(jié)合構(gòu)建的新一代核酸適體傳感器，集成了核酸適體和電化學(xué)傳感器兩方面的優(yōu)勢，成為近年來的一個研究熱點。各種新穎的設(shè)計思路不斷涌現(xiàn)，使電化學(xué)核酸適體傳感器的性能不斷得到改善，來解決分析應(yīng)用中所面臨的一些問題。下面就響應(yīng)原理和存在的問題討論如何設(shè)計一個性能優(yōu)良的電化學(xué)核酸適體傳感器。

1 親和型核酸適體生物傳感器

核酸適體是化學(xué)合成的寡核苷酸，可以很容易在核酸適體的精確位置完成一些功能團（-SH,-NH2,-COOH等）的修飾，從而便于在檢測表面固定理想的核酸適體。通過自組裝或共價連接，在不失去親和力的情況下有序地完成核酸適體的固定化。親和型生物傳感器的基本策略是利用核酸適體和目標分子間的特殊親和力直接設(shè)計。這種電化學(xué)核酸適體傳感器可以分為兩類：非標記型和標記型，如圖1所示。

1.1 非標記型電化學(xué)核酸適體傳感器

1.1.1 阻抗型（EIS）電化學(xué)核酸適體傳感器

阻抗型電化學(xué)核酸適體傳感器是一種無需加入額外的試劑或標記物的新型電化學(xué)生物傳感器。制備EIS核酸適體傳感器，核酸適體的固定化程序至關(guān)重要。一種方法是制備巰基自組裝形成的混合單分子膜，即巰基短鏈分子和巰基核酸適體的雜化膜?；旌夏た梢詼p少電子轉(zhuǎn)移電阻，并為目標物的結(jié)合提供空間。另一種方法是在緊湊的自組裝單層膜上共價固定核酸適體。這樣，由于目標分析物與電極表面間非特異性吸附的消除可以獲得穩(wěn)定的低噪聲背景干擾。

在核酸適體傳感器系統(tǒng)中，如果電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化被認為是關(guān)鍵的影響參數(shù)，可以采用[Fe(CN)6]3-/4-探針來監(jiān)測這一識別過程，也稱法拉第阻抗譜。通過監(jiān)測電子轉(zhuǎn)移電阻的變化可以直接靈敏的觀察固定核酸適體與目標分析物之間的識別過程。被捕獲的目標分析物能阻擋或促進電子轉(zhuǎn)移。

Wang的小組報道了第一例識別誘導(dǎo)表面電荷轉(zhuǎn)換的FIS適體傳感器[9]。研究結(jié)果表明，如果體系 pH（pH 值=7.0）低于目標蛋白 pI（溶菌酶，pI=11),則蛋白質(zhì)的識別將扭轉(zhuǎn)表面電荷狀態(tài)，促進電子轉(zhuǎn)移，因此會降低電子轉(zhuǎn)移電阻。然而，在大多數(shù)關(guān)于FIS核酸適體傳感器的報道中，蛋白質(zhì)識別是會阻礙電子轉(zhuǎn)移的。徐等是第一例在短鏈阻塞模式下進行FIS核酸適體傳感器研究[10]。混合雜化核酸適體膜表面結(jié)合IgE會增加阻抗。在該研究中還比較了基于抗體的生物傳感器，結(jié)果表明，由于核酸適體體積小，結(jié)構(gòu)簡單，在減少背景噪聲和獲得更高的信號方面，基于核酸適體的生物傳感器更有優(yōu)勢。他們采用該方法構(gòu)建的IgE適體傳感器，檢測限為0.1 nmol/L。此后，Radi等做了相似研究[11]，他們發(fā)現(xiàn)用2.0 mol/L NaCl處理10 min后，核酸適體感應(yīng)表面可再生，并且經(jīng)過至少15次重復(fù)檢測再生后，電極行為并沒有很大變化。Hsing等[12]利用FIS建造了用于檢測凝血酶的核酸適體傳感器。他們報道了4個數(shù)量級的檢測范圍，檢測限為0.1 nmol/L。為了提高FIS核酸適體傳感器的靈敏度，F(xiàn)ang的小組發(fā)現(xiàn)了一個放大電阻信號的方法[13]。目標蛋白結(jié)合后，利用鹽酸胍使捕獲的凝血酶變性導(dǎo)致凝血酶的水合半徑增加，從而增大了界面電子轉(zhuǎn)移電阻，檢測限達到1.0×10-14mol/L。

圖1 親和型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.1 Electrochemical aptasensor based on affinity principle

有些實際操作情況下不能加入氧化還原探針。這樣，電極/溶液界面就像是平行板電容器，電容（CSS）成為最重要的參數(shù)。因此，可利用非法拉第阻抗譜(NIS)研究核酸適體與配體的結(jié)合。Cui等報道了第一例利用NIS核酸適體傳感器來檢測血小板生長因子[14]。他們將PDGF-BB的核酸適體共價固定到氨基化的硅表面，隨著PDGFBB的加入，幾秒之后，電容線性降低，檢出限為40 nmol/L。由于NIS技術(shù)不需要加入任何試劑，這種核酸適體傳感器可用于體內(nèi)監(jiān)測。

1.1.2 計時電位溶出型（CPSA）核酸適體傳感器

利用蛋白質(zhì)固有的電活性也可以直接檢測蛋白質(zhì)。Wang的小組十年前就報道了利用CPSA跟蹤肽和蛋白質(zhì)的靈敏方法[15]。他們首次將核酸適體修飾的磁珠與CPSA相結(jié)合，構(gòu)建了無標記化學(xué)法檢測溶菌酶[16]。核酸適體與溶菌酶形成復(fù)合物，經(jīng)分離后采用堿處理，使溶菌酶從磁珠上釋放出來，分離出磁珠，剩下的溶菌酶利用酪氨酸和色氨酸殘基的氧化進行CPSA分析，檢測下限可達 350 fmol（7 nmol/L）。

1.1.3 場效應(yīng)晶體管型（FET）核酸適體傳感器

場效應(yīng)晶體管轉(zhuǎn)化器是構(gòu)建電化學(xué)核酸適體傳感器的另一種方法。在源極和漏極之間的通道固定傳感元件是制備FET生物傳感器的關(guān)鍵。為檢測源-漏電流的變化，固定化傳感層的厚度一般都要比德拜距離小[17～19]，否則識別后帶電荷的蛋白被相反電荷的離子所屏蔽，檢測不到信號?？乖?抗體體系則不適用于這種類型適體傳感器的構(gòu)建。在鹽溶液中抗體典型尺寸約為10～15 nm，那么抗原結(jié)合將超過德拜距離（3 nm，10 nmol/L離子濃度），無法檢測到信號。而核酸適體的尺寸很?。s為1～2 nm），故適用于FET傳感器的設(shè)計，識別過程很容易在雙電層距離內(nèi)進行并被檢測到。Lee等首次報告了用于凝血酶檢測的單壁碳納米管場效應(yīng)晶體管(SWNT-FET)核酸適體傳感器[20]。SWNT-FET大多是采用標準化學(xué)氣相沉積技術(shù)制備的，凝血酶核酸適體是被共價結(jié)合在改性的碳納米管上。這種傳感器響應(yīng)迅速，檢測限為10 nmol/L。Maehashi和Tamiya報道了另一種基于適體的碳納米管場效應(yīng)晶體管(CNT-FETs)傳感器，對IgE的檢測下限為250 pmol/L[21]。

1.1.4 吸附電活性指示劑型核酸適體傳感器

利用電化學(xué)活性指示劑，如電活性小分子或離子聚合物，也可設(shè)計非標記型適體傳感器。Hianik等利用亞甲基藍（MB）作為電活性指示劑來檢測核酸適體與凝血酶的相互作用。MB分子可以很容易地吸附到凝血酶上，MB的電信號響應(yīng)就可以直接指示凝血酶的濃度，檢測限為10 nmol/L[22]。

從靜電作用方面來考慮，修飾核酸適體的電極帶負電，如果加入帶正電的聚合物探針，通過靜電引力可以使其結(jié)合到電極表面。如果有目標蛋白質(zhì)存在，蛋白質(zhì)-核酸適體的結(jié)合會阻礙陽離子聚合物靠近電極表面，因此，骨架上帶有電活性官能團的離子聚合物是可以檢測電極表面核酸適體與目標蛋白相互作用的。 Leclerc等報道了利用2，4-二茂鐵陽離子取代的聚噻吩作為電活性指示劑來直接檢測凝血酶的方法[23]。該研究采用方波伏安法（SWV）來檢測，電極表面有凝血酶結(jié)合時，二茂鐵的電流信號被抑制，但沒有做定量分析。

1.2 標記型電化學(xué)核酸適體傳感器

核酸適體的靶物質(zhì)如果是小分子，如腺苷等，適體結(jié)合時會將其包埋于特定的立體構(gòu)象袋中，不能再結(jié)合其它適體。靶物質(zhì)是蛋白質(zhì)等大分子時，就可能含有兩個以上結(jié)合適體的活性位點。對于后者，可以采用類似于免疫分析的策略，如夾心法和競爭法來設(shè)計標記型電化學(xué)核酸適體傳感器。

1.2.1 酶標夾心型核酸適體傳感器

夾心法廣泛應(yīng)用于免疫分析中。對于蛋白質(zhì)分析，夾心法是一種理想的選擇，因為目標蛋白分析物不需要標記。某些蛋白質(zhì)，如凝血酶，存在多個結(jié)合位點可以和不同的特異性核酸適體結(jié)合。這就使得夾心型核酸適體傳感器的設(shè)計成為可能。捕獲核酸適體探針被固定在電極表面，檢測適體探針上標記酶，用于電催化信號放大。Ikebukuro等首次報道了利用兩種不同的凝血酶作為核酸適體的夾心型電化學(xué)適體傳感器[24～25]。核酸適體Ⅰ固定在金電極上用于識別，葡萄糖脫氫酶（GDH）標記的核酸適體Ⅱ用于產(chǎn)生電信號。結(jié)果顯示，采用對氧氣不敏感的((PQQ)GDH)標記比GDH標記更靈敏，檢測限為10 nmol/L，而用GDH作標記檢測限為1 μmol/L。在夾心體系中，能夠產(chǎn)生放大電信號的多功能標記物非常適用。Katakis等利用辣根過氧化酶標記的核酸適體發(fā)展了用于凝血酶檢測的夾心型適體電化學(xué)傳感器[26]。然而，由于酶標適體非特異性吸附比較強，檢測限比較高（80 nmol/L）。

1.2.2 納米粒子標記夾心型核酸適體傳感器

金屬納米粒子(NP)是另一種能夠催化電化學(xué)信號放大的標記物，它也被用于夾心型核酸適體電化學(xué)傳感器的設(shè)計。Willner小組報道了鉑納米粒子標記的核酸適體用于夾心型傳感器的設(shè)計，用于凝血酶的分析[27]。但他們的研究中，用于捕捉和檢測的核酸適體是同一種。夾心反應(yīng)后，鉑納米粒子催化H2O2還原產(chǎn)生催化電流。由于凝血酶層產(chǎn)生的高電子轉(zhuǎn)移電阻，催化電流只能在極低的掃描速率下(20 mV/s)觀察到，檢測限在1 nmol/L左右。Fang的小組基于磁性納米粒子標記的核酸適體和金納米粒子標記的核酸適體，設(shè)計了一種靈敏的用于凝血酶檢測的電化學(xué)生物傳感器[28]。夾心反應(yīng)后，采用磁場將免疫復(fù)合物（磁性納米粒子標記適體/凝血酶/金標適體）富集純化。在鹽酸溶液中，Au納米粒子在高電位下被氧化成Au(Ⅲ)，再采用差分脈沖伏安法(DPV)檢測還原電流。此方法靈敏度高，檢出限可達1.42 pmol/L。

1.2.3 量子點（QD）標記競爭型核酸適體傳感器

將電化學(xué)溶出測量與量子點示蹤相結(jié)合已經(jīng)被證實是一種靈敏有效方法用于蛋白質(zhì)的生物分析。利用量子點電化學(xué)編碼來做信號增強的復(fù)雜蛋白質(zhì)分析近年來引起了廣泛的研究興趣。Wang等設(shè)計了競爭型多分析物電化學(xué)核酸適體傳感器用于凝血酶和溶菌酶的同時檢測[29]。首先，將巰基核酸適體及其相應(yīng)的量子點標記蛋白固定在金表面上。然后加入待分析蛋白樣品來取代標記的蛋白。洗滌后，將剩下的CdS和PbS量子點溶解，在修飾的玻碳電極上進行溶出伏安分析。由于量子點的有效放大作用，可以獲得亞皮摩爾級的檢測限。與傳統(tǒng)的抗原-抗體免疫檢測相比，量子點電化學(xué)核酸適體傳感器更加靈敏，這可能得益于標記蛋白與緊密修飾核酸適體的電極表面間低的親合力。

2 構(gòu)型變換型適體生物傳感器

當核酸適體與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合時，有典型的構(gòu)型變換，而抗體則沒有這樣的特性。這個性質(zhì)可以被用來設(shè)計構(gòu)型變換型適體傳感器，原理如圖2所示。

圖2 構(gòu)型變換型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.2 Electrochemical aptasensor based on Conformation change principle

2.1 分子內(nèi)構(gòu)型變換型

1996年首次報道了熒光分子信標作為無標記無試劑型探針用于目標DNA分析[30～32]。分子信標包含一個用于信號產(chǎn)生的莖部和一個用于與核酸互補雜交的環(huán)部。加入目標寡核苷酸，隨著雜化的進行，結(jié)合的莖結(jié)構(gòu)打開并自發(fā)的產(chǎn)生構(gòu)型變換。這種構(gòu)型變換是合理的，因為雜化時產(chǎn)生的吉布斯自由能降低比莖部結(jié)合時要大。這種構(gòu)型變換已被用于設(shè)計各種淬滅和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）型分析[33～34]。 已有不少研究者在探索將環(huán)部采用適體序列取代，發(fā)展類似熒光原理的基于適體信標的電化學(xué)傳感器。通常，將適體信標的一端修飾官能團用于在電極表面的固定化，另一端修飾電活性標記物來產(chǎn)生電信號。標記物的氧化還原反應(yīng)是距離決定的。識別后，分子內(nèi)構(gòu)型變換改變了電化學(xué)標記物和電極表面的距離，產(chǎn)生可測的信號改變[35～36]。這種構(gòu)型變換既可以設(shè)計信號減弱（signal-off）型，也可以設(shè)計信號增強型（signal-on）適體傳感器。

在之前的研究中，Plaxco小組使用標記有MB的巰基化32-堿基凝血酶適體設(shè)計了一種無標記signal-off型電化學(xué)適體傳感器檢測血清中的凝血酶（2005年7月）[37]。在結(jié)合前，適體保持非折疊構(gòu)型，使MB分子碰撞電極表面并轉(zhuǎn)移電子。加入凝血酶，信標適體折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)以利于凝血酶-適體間發(fā)生適應(yīng)性結(jié)合作用。由于靶物質(zhì)的結(jié)合引起標記物與電極距離增加，所以電子轉(zhuǎn)移受到抑制。這種電化學(xué)適體傳感器的關(guān)鍵優(yōu)勢是寬的線性響應(yīng)范圍（從納摩爾到微摩爾）和能夠?qū)崿F(xiàn)血清樣品中凝血酶的靈敏檢測。這種基于靶物質(zhì)的結(jié)合引起構(gòu)型變換的電化學(xué)適體傳感器，提供了一種無試劑、再生和靈敏的方法用于復(fù)雜樣本中目標分析物的檢測。但signal-off型適體傳感器也有其局限性。目標分析物的結(jié)合減小了而不是增大了電化學(xué)信號。信號增溢是受限制的，因為最多只有100%的信號被抑制。并且，污染物以及其它物質(zhì)所產(chǎn)生的“假信號”與特異靶物質(zhì)的結(jié)合所產(chǎn)生的信號很難區(qū)別。上述難題采用signal-on型適體傳感器很容易解決，因為靶物質(zhì)的識別會帶來較大的信號增強。

Radi等報道了一種用二茂鐵作為氧化還原標記物的巰基化15-堿基凝血酶適體用于研究，獲得了與Plaxco不同的signal-on結(jié)果[38]。主要原因是適體堿基長度的不同和阻斷分子巰基乙醇的引入。他們認為信號增強是凝血酶的結(jié)合引起了從隨機卷曲構(gòu)型到四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)構(gòu)型變換。形成四聯(lián)體后，二茂鐵向電極表面靠近，氧化電流增強。

還有些適體與靶物質(zhì)結(jié)合后形成三維空間結(jié)構(gòu)，而靶物質(zhì)不存在的情況下只與其中一個莖相接觸，仍部分地保持未折疊。Plaxco小組利用構(gòu)型變換設(shè)計了檢測可卡因和PDGF-BB的電化學(xué)適體傳感器。他們利用MB標記的巰基化適體部分的未折疊結(jié)構(gòu)在電極表面形成自組裝單分子層[39]。當加入目標分析物可卡因，適體很快折疊成與可卡因結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，減小了MB標記物與電極表面的距離，峰電流增大，此方法的檢測限為10 μmol/L。在80 s內(nèi)就可以獲得97%的變化，4 min內(nèi)全部完成。該傳感器在室溫下簡單的沖洗就能再生。另一種PDGF-BB適體傳感器[40]，在目標物存在時適體也變換成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，使MB標記物接近電極表面。這種傳感器可在未稀釋的血清中1 nmol/L PDGF-BB和50%血清中50 pmol/L PDGF-BB的直接檢測。這種基于分子內(nèi)構(gòu)型變換的電化學(xué)適體傳感器提供了一些有效的方法，來解決采用熒光分子信標測試臨床樣品時存在的高背景干擾問題?；诜肿觾?nèi)構(gòu)型變換的信標適體電化學(xué)傳感器背景干擾要比熒光小很多，有望在臨床分析中得到應(yīng)用。

適體上富含鳥嘌呤而形成緊密的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。 這種結(jié)構(gòu)在一價陽離子特別是鉀離子中能穩(wěn)定存在。也就是說，鉀離子與富G適體有特異結(jié)合能力，并能夠促進適體從松散的卷曲結(jié)構(gòu)到穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這就使設(shè)計鉀離子型電化學(xué)適體傳感器成為可能。Radi等首先報道了基于構(gòu)型變換的鉀離子選擇性識別的電化學(xué)適體傳感器[41]。檢測限約為0.015 mmol/L。

一些平面染料分子可以插入雙鏈DNA中并經(jīng)DNA堿基對π堆積實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移而被氧化。這個原理也被用于設(shè)計信標適體傳感器用于靶分子的檢測。Kim等使用MB作為電化學(xué)標記物提出了基于信標適體的電化學(xué)檢測方法[42]。共價固定的信標適體呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)，這樣MB分子就可以插入到莖部雙鏈中，當遇到目標物凝血酶，信標產(chǎn)生構(gòu)型變換，凝血酶與環(huán)部結(jié)合打開結(jié)合的莖部，并釋放MB分子，引起MB峰電流的減小，檢測限為11 nmol/L。

2.2 目標誘導(dǎo)鏈置換型

Plaxco等將“目標誘導(dǎo)鏈置換”策略引入到電化學(xué)適體傳感器的設(shè)計中[43]。在金電極上組裝巰基化DNA適體的單分子層，該DNA適體鏈包含一段15個堿基的凝血酶適體和一段適體與巰基間的連接序列。然后，加入既能與適體片段又能與連接序列雜化的MB標記的寡核苷酸。形成的剛性雙鏈結(jié)構(gòu)能夠阻止MB與電極表面接觸。加入凝血酶后，適體片段折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)結(jié)合凝血酶，釋放出標記MB的寡核苷酸片段，產(chǎn)生易松散的鏈，使MB標記物接近電極表面，產(chǎn)生電流，其檢測限是3 nmol/L。但該傳感器不可再生。Wu等在一個類似的研究中報道了腺苷誘導(dǎo)鏈置換，使二茂鐵標記的適體從傳感界面上分離出來，設(shè)計了一種signal-off型電化學(xué)適體傳感器[44]。

多數(shù)基于構(gòu)型變換的適體傳感器的設(shè)計總有一種狀態(tài)是松散結(jié)構(gòu)要么是 “on”要么是“off”狀態(tài)。在這種松散結(jié)構(gòu)中，電化學(xué)信號是通過末梢的標記物與電極表面動態(tài)碰觸產(chǎn)生的，這就使信號響應(yīng)受到限制。如果能夠設(shè)計構(gòu)型明確的“on”或“off”型剛型結(jié)構(gòu)，就能克服這些缺點。Fan等設(shè)計了檢測三磷酸腺苷(ATP)的電化學(xué)適體傳感器[45]，他們使用的長鏈DNA由適體片段、雙鏈部分和阻斷部分組成，適體片段用于高親和性ATP識別，與互補鏈雜化的雙鏈部分用于支撐結(jié)構(gòu)。標記3'-SH和5'-二茂鐵的DNA適體首先以雜交雙鏈形式自組裝到金表面。在這種剛性的長結(jié)構(gòu)中，二茂鐵的電子轉(zhuǎn)移效率低。ATP的加入使雙鏈結(jié)構(gòu)破壞，并使互補DNA鏈解開。這樣，由于剛性的ATP-適體三級結(jié)構(gòu)的形成促使二茂鐵標記物靠近電極表面，產(chǎn)生可測電流。由于雜交雙鏈結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都是剛性的，適體傳感器具有明確的“signal-off”和“signal-on”結(jié)構(gòu)狀態(tài)，檢測限可以覆蓋nmol/L到mmol/L范圍。

3 酶參與型

適體與目標蛋白質(zhì)的特異結(jié)合將改變一些酶反應(yīng)的特性，例如核酸酶的水解反應(yīng)和等溫滾環(huán)擴增(RCA)反應(yīng)等。這些反應(yīng)特性可以被用來設(shè)計一些基于酶參與型的適體傳感器，原理如圖3所示。

圖3 酶參與型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.3 Electrochemical aptasensor based on enzyme-participated strategies

適體是合成寡核酸或多肽分子，很容易被核酸酶水解。但有目標蛋白質(zhì)存在時，形成的適體-蛋白質(zhì)復(fù)合體會阻止適體的降解。Leclerc等利用這種特性設(shè)計了一種基于適體檢測的凝血酶電化學(xué)適體傳感器。該研究使用了與適體互補的單鏈肽核酸(PNA)和陽離子噻吩高聚物[23]。特異的適體首先加入到凝血酶溶液中形成適體-凝血酶復(fù)合體。然后，加入核酸酶水解溶液中剩余的適體，只留下鍵合的適體。在95℃下處理10 min，使蛋白質(zhì)變性，結(jié)合的適體被釋放到溶液中。滴加1 μL該溶液到中性PNA探針修飾的電極上實現(xiàn)檢測。PNA-適體雜化后，電極表面帶負電荷。將其浸泡在陽離子高聚物中，通過靜電作用將陽離子聚合物吸附到電極上，形成PNA-適體-高聚物復(fù)合體，產(chǎn)生“signal on”型電化學(xué)響應(yīng)，實現(xiàn)了凝血酶的定量分析，檢測下限是75 nmol/L。

環(huán)狀 DNA 適體(“captamers”)是將兩種或更多折疊適體以及核酸雙鏈或聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)包含在一個環(huán)狀分子中的DNA[46～47]。適體處于聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)的頂端，可以提供多個蛋白質(zhì)結(jié)合活性位點。與傳統(tǒng)的適體相比，這種環(huán)狀DNA適體具有更高的熱穩(wěn)定性和更好的耐核酸酶降解特性。Captamer正如環(huán)狀DNA一樣可以用作RCA反應(yīng)的模板。King等采用環(huán)狀DNA適體設(shè)計了聚合酶介導(dǎo)的臨近延伸 “proximity extension”法用于蛋白質(zhì)的定量檢測[48]。該方法采用了一個啞鈴狀Captamer和一條線性適體，它們各含有一個凝血酶的識別位點，當有目標物存在時，Captamer和線性適體的一端像鉗子一樣將凝血酶夾住，線性模板的另一端與Captamer的環(huán)狀頂端可以雜交，提供后繼酶介延伸和等溫擴增的引物。Captamer就成為隨后等溫擴增的模板。當有凝血酶存在時，通過酶介擴增反應(yīng)，產(chǎn)生環(huán)狀模板序列循環(huán)復(fù)制的長鏈高分子產(chǎn)物。將產(chǎn)物設(shè)計成含有限制性內(nèi)切酶的識別位點，就可以將其切割成期望長度的DNA片斷。為了實現(xiàn)電化學(xué)檢測，大約35%的擴增反應(yīng)的核苷酸采用電活性核苷酸取代 (vinyl-FcdUTP)。該電活性DNA片斷能夠被互補鏈捕獲到電極表面，采用方波伏安法（OSWV）檢測，線性響應(yīng)范圍從pmol/L到nmol/L。

楚等提出了另一種基于免疫-RCA的適體電化學(xué)傳感器用于PDGF-BB的超靈敏檢測[49]。在電極表面形成一種像抗體-PDGF-BB-適體-引物復(fù)合體這樣的三明治結(jié)構(gòu)后，引入一種與引物結(jié)合的“C”形掛鎖探針，該探針提供了后續(xù)RCA反應(yīng)的模板，在DNA聚合酶和dNTPs存在時，發(fā)生等溫擴增產(chǎn)生長鏈RCA產(chǎn)物，該產(chǎn)物的電化學(xué)檢測與King等不同之處在于引入了生物素標記的檢測探針和親和素標記的ALP酶，利用生物素-親和素的特異結(jié)合作用和探針雜交，將ALP酶結(jié)合到RCA產(chǎn)物上，ALP酶催化銀沉積，再采用溶出伏安法檢測。該方法結(jié)合了滾環(huán)擴增和酶催化金屬沉積兩步放大，實現(xiàn)了超靈敏的選擇性檢測，檢測范圍跨越4個數(shù)量級，下限可達10 fmol/L。黃等采用類似原理將PDGF-BB采用抗體和適體-引物捕獲到電極表面[50]，然后引入的是一個單鏈環(huán)形質(zhì)粒DNA，在聚合酶作用下延伸形成環(huán)形雙鏈DNA，通過嵌入亞甲基藍分子產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，該傳感器檢測下限為18 pg/mL。

4 表面臨近雜交型

Fredriksson等2002年在 Nature Biotechnology上發(fā)表了基于鄰近分析檢測蛋白質(zhì)的研究[51]，首次提出了鄰近分析的概念。鄰近分析是指一對親和探針同時識別目標分子并與目標分子高親和力的結(jié)合，形成了一對鄰近的探針，從而使檢測信號增強。這些報道大多是溶液的均相反應(yīng)，蔣等將這一概念應(yīng)用到適體傳感器的設(shè)計，提出了表面臨近雜交型電化學(xué)適體傳感器[52]，原理如圖4所示。一對相同的核酸適體同時識別以二聚體形式存在的PDGF-BB后，由于臨近效應(yīng)使適體探針兩尾端序列同時與電極表面固定的兩條短鏈DNA雜交，適體末端修飾了二茂鐵，這種臨近雜交促使二茂鐵充分靠近電極表面，產(chǎn)生顯著的氧化還原電流。該傳感器響應(yīng)范圍可從1.0 pg/mL到20 ng/mL，檢測限可達1.0 pg/mL。他們還將表面鄰近雜交分析技術(shù)推廣應(yīng)用到核酸分子靶標的電化學(xué)傳感器構(gòu)建中[53]。

圖4 表面臨近雜交型核酸適體電化學(xué)傳感器原理Fig.4 Electrochemical aptasensor based on proximity-dependent surface hybridization principle

總的來說，雖然研究者們已經(jīng)探索了多種構(gòu)建核酸適體電化學(xué)傳感器的方法，并獲得了較滿意的分析性能，但適體電化學(xué)傳感器的研究仍處于它的初級階段，還有很多重要問題值得深入研究。理論上任何目標物的適體都能夠合成和應(yīng)用，但實際上只有少數(shù)蛋白質(zhì)和小分子的核酸適體得到研究。隨著SELEX技術(shù)的發(fā)展，更多具有高親和力和低成本的適體可以合成出來，作為抗體的替代物或補充用于適體生物傳感器的構(gòu)建。目前，對電化學(xué)適體傳感器的分析性能和各項參數(shù)，如選擇性、特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和線性響應(yīng)的研究和評價都不充分，在實際體系中的應(yīng)用也還需要拓展。因此，今后電化學(xué)核酸適體電化學(xué)傳感器的發(fā)展還是在以下幾個方面：利用納米生物新技術(shù)發(fā)展新的信號擴增方法，獲得超靈敏的信號響應(yīng)；探索新的檢測原理和分析技術(shù)，發(fā)展操作簡便可控，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的通用型新方法；尋找對更多靶分子具有高親和力的核酸適體，在免疫分析難以解決的研究領(lǐng)域拓展核酸適體傳感器的應(yīng)用，解決一些具體問題；建立基于電化學(xué)核酸適體的高通量分析技術(shù)；利用電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢，發(fā)展能自動化和實時監(jiān)測的分析新技術(shù)。

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