金絲桃苷對體外腫瘤細胞增殖的抑制作用研究

王麗敏,江清林,畢士有,史偉國,趙錦程,張明遠

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

貫葉金絲桃為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物,具有清熱解毒、抗抑郁、抗病毒等功效[1]。金絲桃苷(Hyperin,Hyp)屬黃酮醇苷化合物,是金絲桃屬植物的特征性成分之一。金絲桃苷毒性小,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)等多種藥理學活性[2,3]。現(xiàn)在人們對金絲桃苷的毒理、藥理等基礎(chǔ)研究都做了大量的工作,并取得了豐碩的成果,但是金絲桃苷對體外腫瘤細胞增殖的抑制作用研究卻少有報道。本實驗選用人肺腺癌細胞 A549、結(jié)腸癌細胞 HCT8及前列腺癌細胞 PC3作為研究對象,對金絲桃苷體外抗腫瘤作用進行初步探討,從而為開發(fā)出金絲桃苷的臨床新用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞、HCT8細胞及 PC3細胞均購于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所。金絲桃苷購自北京生物制品研究所,用二甲基亞砜溶解(終濃度≤0.01%),用含 2%小牛血清RPM I1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度;四甲基偶氮唑藍(M TT)、胰蛋白酶購自美國 Sigma公司;小牛血清、青-鏈霉素雙抗、RPM I1640培養(yǎng)液購自天津灝洋生物公司;Fax-3200酶標儀購自美國 Awareness公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞、HCT8細胞及 PC3細胞的培養(yǎng)

人腫瘤細胞 A549、HCT8、PC3均為貼壁生長細胞,加入含 10%小牛血清,100U/mL青-鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液,置于 37℃恒溫、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化、傳代、繁殖細胞。

1.2.2 A549細胞、HCT8細胞及 PC3細胞形態(tài)的變化

取對數(shù)生長期腫瘤細胞用 0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞,用含 10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液 ,以每孔 1× 105個細胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后,換液,加入不同濃度的金絲桃苷 (0.625 μg/mL,1.25 μg/mL,2.5μ g/mL,5μ g/mL,10 μg/mL,20μ g/mL)。 同時設(shè)陰性對照組為不加藥物只加等量二甲基亞砜;另設(shè)終濃度為 10 μg/mL的 5-FU陽性對照組及不加細胞只加等量藥物的空白對照組。置 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng) 24h、48h、72h。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及存活狀態(tài)。

1.2.3 M TT法檢測金絲桃苷對腫瘤細胞的生長抑制作用

取對數(shù)生長期 A549細胞、HCT8細胞及 PC3細胞消化后,配成單細胞懸液,以每孔 1×105個細胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔體積 100μL,培養(yǎng) 24 h后,換液,加入不同濃度的金絲桃苷 (0.625μ g/mL,1.25 μg/mL,2.5 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20μ g/mL),藥物的每一濃度設(shè) 4個復孔,同時設(shè)終濃度為 10 μg/mL的 5-FU陽性對照組及陰性對照組和空白對照組。加藥后再分別培養(yǎng) 24h、48h、72h,每孔加入 MTT溶液(5mg/mL)10 μL,37℃,繼續(xù)孵育 4h。終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入 100μLDM SO,振蕩 10min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇 490nm波長,在酶標儀上測定各孔光吸收值(OD值),計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=(對照孔 OD值-實驗孔 OD值 )/對照孔 OD值×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,組間顯著性差異經(jīng) t檢驗驗證,以 P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長形態(tài)變化

在倒置顯微鏡下可見 A549細胞呈現(xiàn)長梭形,HCT8細胞呈多角形或梭形,PC3細胞呈不規(guī)則梭形。培養(yǎng) 24h、48h、72h后,對照組三種細胞均單層貼壁,細胞數(shù)量較多,形態(tài)正常,生長狀態(tài)良好。金絲桃苷組、陽性對照組細胞培養(yǎng) 24h后,細胞數(shù)量減少 ,細胞形態(tài)仍基本正常。金絲桃苷組、陽性對照組細胞培養(yǎng) 48h后,細胞數(shù)量明顯減少,金絲桃苷濃度高于 5 μg/mL以上時,大量細胞變圓浮起,細胞形態(tài)較難辨認。金絲桃苷組、陽性對照組細胞培養(yǎng) 72h后,細胞稀少,金絲桃苷濃度高于 2.5 μg/mL時,多數(shù)細胞變圓浮起,當濃度達到 10 μg/mL時已難辨認正常細胞的存在 ,絕大部分呈壞死碎片。

2.2 M TT比色實驗

從表1、表2及表3結(jié)果可知,金絲桃苷體外可抑制人肺腺癌細胞 (A549)、人結(jié)腸癌細胞(HCT8)、人前列腺癌細胞(PC3)的增殖,在 0.625至 20 μg/mL的范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時間依賴性。作用 24h、48h、72h時隨著劑量的增加,抑制作用更加明顯,而且隨著時間的增加,抑制作用變化明顯。表明金絲桃苷對三種腫瘤細胞均有較強的細胞毒活性,其中A549細胞及 HCT8細胞對金絲桃苷的敏感性最高。支嚴重病變,綜合分析考慮該患者冠脈發(fā)生如此嚴重病變可

表1 金絲桃苷對 A549細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表1 金絲桃苷對 A549細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與5-FU對照組比較,*P＞ 0.05。

表2 金絲桃苷對 HCT8細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表2 金絲桃苷對 HCT8細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與 5-FU對照組比較,*P＞ 0.05。

表3 金絲桃苷對 PC3細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表3 金絲桃苷對 PC3細胞生長抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與5-FU對照組比較,*P ＜0.05。

3 討論

近年來,植物藥在惡性腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用,天然植物藥毒性低、療效好,日益受到重視,成為治療腫瘤的希望和新途徑,是當前抗腫瘤新藥研究的主要發(fā)展方向。細胞通過分裂生成和本身相同的細胞群體也就是增殖來完成生長過程。腫瘤借助腫瘤細胞的分裂增殖而不斷地生長發(fā)展。癌細胞不斷增生是其侵襲發(fā)生的前提之一,抗腫瘤藥可通過抑制和殺滅細胞增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)來阻斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。因此我們選擇了三種人源癌細胞來研究金絲桃苷體外抗腫瘤活性。實驗方法采用 M TT法。實驗結(jié)果表明,金絲桃苷在一定濃度范圍內(nèi)具有顯著的抑制腫瘤細胞生長的作用,可作為一種天然、低毒、有效的防癌抗癌物質(zhì)在腫瘤的治療和預防過程中發(fā)揮重要的作用。關(guān)于金絲桃苷抗腫瘤作用機制有待于進一步研究。

[1] Josey E S,Tackett R L.St John’s wort:a new alternative for depression[J].International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics,1999,37(3):111-113

[2] Song BW,M a CG,Xu SY.A new peripheral anlgesic agent:hyperin Asia pacific[J].J Pharmacoc,1988,3(2):1-2

[3] 李慶林,陳志武,馬傳庚.金絲桃苷對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺氧-再給氧損傷的影響[J].中草藥,2006,37(4):575-5771995,267(10):1445-1449