基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子α在大鼠光氣吸入性肺損傷中的表達(dá)及意義

張琳 申捷 黃文彬 何岱昆

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院化學(xué)傷害醫(yī)療救治中心,上海 200540)

光氣是無色,具有爛干草味的窒息性氣體,是重要的化工原料,廣泛用于橡膠、塑料、染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥等領(lǐng)域。在第一次世界大戰(zhàn)期間,光氣曾被用作軍事毒劑。因此,聯(lián)合國(guó)裁軍委員會(huì)將光氣定為“雙用途毒劑”[1]。由于光氣用途廣泛,人們對(duì)其接觸機(jī)會(huì)多,常因防護(hù)不當(dāng)或意外泄露而致人員中毒,導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury,ALI),甚至發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),危及生命。但目前光氣對(duì)人體的中毒機(jī)制尚不清楚[2],中毒后特效療法,故研究光氣中毒機(jī)制具有重要意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)又稱明膠酶B[3],是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一種,可由多種炎性細(xì)胞產(chǎn)生,包括中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞以及結(jié)締組織細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠光氣吸入性肺損傷的模型,采用分子生物學(xué)方法探討MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的表達(dá)和意義及其與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的關(guān)系 。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取SPF級(jí)SD大鼠50只,雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g,由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為空氣對(duì)照組(10只)和光氣染毒后 2、4、6、8 h 組(每組各10只),分別記為O、A、B、C、D組。光氣染毒組置于動(dòng)態(tài)染毒柜中,導(dǎo)入濃度為 8.33 mg?L-1的光氣(光氣純度為100%,由固體三光氣溶于環(huán)己烷在N,N-二甲基甲酰胺作用下產(chǎn)生,染毒方法根據(jù)文獻(xiàn)[4]略做改動(dòng))染毒5min;對(duì)照組動(dòng)物置于染毒柜內(nèi),除導(dǎo)入同樣流量的空氣之外,其余條件與染毒組完全相同。

1.2 病理組織學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦(1mL?kg-1)麻醉,心臟穿刺放血處死。開胸取右中上肺,4%甲醛固定,石蠟包埋,4μm切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.3 肺損傷的評(píng)價(jià) ①肺濕/干質(zhì)量(W/D)比值取右下肺,輕輕擦干表面,立即稱質(zhì)量記為肺濕質(zhì)量。然后置于80℃烤箱內(nèi),48 h后稱質(zhì)量記為肺干質(zhì)量,計(jì)算濕/干質(zhì)量比值。②支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白濃度 處死大鼠后立即行氣管插管,結(jié)扎右側(cè)主支氣管,以37℃0.9%氯化鈉液對(duì)左肺行支氣管肺泡灌洗,連續(xù)灌洗3次。收集灌洗液5mL于4℃800×g離心10min,回收上清液置于-20℃冰箱待檢測(cè)蛋白含量。Lowry法測(cè)定蛋白含量。③支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞數(shù)目用血球計(jì)數(shù)板計(jì)細(xì)胞總數(shù)后,將灌洗液4℃3000 r?min-1離心10min,上清液置于-20℃保存待生化測(cè)定,沉渣用于做細(xì)胞涂片,Wright-Giemsa染色,進(jìn)行細(xì)胞分類(至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞),計(jì)算總細(xì)胞數(shù)目。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)法測(cè)定BALF中TNF-α和MMP-9含量 操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行,酶標(biāo)溶解度波長(zhǎng)以450 nm讀取吸光值,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的吸光值。TNF-α和MMP-9放射免疫盒均由由美國(guó)R&D systems公司生產(chǎn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)MMP-9 mRNA水平 取左肺置于-70℃冰箱保存。用T rizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從肺組織中提取總RNA。引物由上海賽百盛公司合成。MMP-9引物序列:上游引物 5′T TCAAGGACGGACGGTCGGTAT T3′,下游引物5′CTCTGAGCCTAGACCCAACTTA3′,產(chǎn) 物 為228 bp cDNA片斷。β-Actin引物序列:上游引物5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′,下游 引物 5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT 3′

具體步驟:(1)DNA酶處理完全去除殘留DNA。(2)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。(3)以cDNA為模板做PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:95℃5min,95℃30 s,48℃30 s,72℃30 s(60循環(huán))。然后進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)。

為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5 S升高1℃)實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)各樣品加樣量均為2μL,然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響,每個(gè)樣品取2μL體積的cDNA含量并不完全相同,為校正此差異,我們使用管家基因β-actin作為內(nèi)參,以樣品待測(cè)基因得值除以此樣品內(nèi)參得值,最終得到的比值為樣品的待測(cè)基因相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察 實(shí)驗(yàn)中觀察到染毒組大鼠雙足撓鼻,呼吸急促,心率加快,取肺可觀察到雙肺膨脹,體積增大,質(zhì)量增加,色澤暗紅,表面有明顯出血點(diǎn),氣管插管時(shí)可見粉紅色泡沫液體溢出,光鏡下觀察到肺組織結(jié)構(gòu)顯著改變,肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞漏出和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)水腫增厚。對(duì)照組大鼠肺組織表面無出血點(diǎn),光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)完好,肺泡腔內(nèi)無細(xì)胞滲出,肺間質(zhì)清晰。病理觀察見圖1～2。

2.2 肺濕/干質(zhì)量比和BALF中蛋白含量及中性粒細(xì)胞數(shù)目 動(dòng)物染毒后肺濕/干質(zhì)量比和支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量逐漸增大,表明肺水腫逐漸加重,各組與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.05),見表1。

表1 光氣染毒后肺濕/干質(zhì)量比和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的變化

2.3 BALF中 TNF-α和MMP-9含量 見表2。

表2 BALF中 TNF-α和MMP-9含量

2.4 RT-PCR結(jié)果分析 結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠肺組織中也有MMP-9 mRNA的微量表達(dá),以對(duì)照組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA的表達(dá)含量設(shè)為1,染毒組大鼠較對(duì)照組MMP-9 mRNA的表達(dá)含量顯著增高(P＜0.01),染毒組大鼠MMP-9 mRNA的表達(dá)含量隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。光氣染毒后8h組MMP-9mRNA的表達(dá)量較其他各組顯著增高(P＜0.01)。見圖3～4。

圖3 MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖4 M MP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠吸入光氣2 h后即出現(xiàn)典型ALI表現(xiàn),主要表現(xiàn)為光氣致傷大鼠整個(gè)肺充血,表面可見斑片狀或者點(diǎn)狀的出血灶;光鏡下顯示肺間質(zhì)水腫,彌漫性出血,肺泡內(nèi)可見大量紅細(xì)胞滲出和中性粒細(xì)胞、血漿蛋白浸潤(rùn);肺濕/干質(zhì)量、肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)、蛋白含量以及肺血管的通透性均較對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)表明,在光氣所致的急性肺損傷中不僅血管內(nèi)皮細(xì)胞存在一定程度的損傷,而且肺泡上皮也受損,致使大量的蛋白和中性粒細(xì)胞等血管內(nèi)容物滲漏到肺泡腔內(nèi),致肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著升高,肺濕/干質(zhì)量比增加,表明肺水增加,這些變化均符合ALI的生物標(biāo)志(肺水增加、肺毛細(xì)血管通透性增加、肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)和蛋白濃度增加等改變)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,隨光氣染毒后時(shí)間的延長(zhǎng),肺組織損傷加重,這證實(shí)光氣中毒可引起的遲發(fā)性肺水腫。

光氣經(jīng)人體吸入后經(jīng)一定潛伏期(最長(zhǎng)24 h)可導(dǎo)致肺水腫甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),其主要病變是中毒性肺水腫,中毒機(jī)制假說頗多,包括諸如?；饔?、直接作用、鹽酸作用、神經(jīng)反射作用、肺血流動(dòng)力學(xué)改變等,各有實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但任何一種假說都不能完滿地解釋肺水腫發(fā)生與發(fā)展過程。

MMP是一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源,能降解細(xì)胞外基(ECM)蛋白的內(nèi)切酶的總稱,MMP-9是其中一種,可以通過以下作用參與肺損傷過程:①M(fèi)MP-9直接作用于肺泡毛細(xì)血管基膜,使其通透性增加。MMP-9還可以水解血管內(nèi)皮細(xì)胞的鈣黏附素(cadherin)和閉合蛋白(occludin)這兩種細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)直接導(dǎo)致微血管通透性增加[5]。②MMP-9通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平,從而參與ALI的發(fā)生、發(fā)展。MMP-9可將相對(duì)分子質(zhì)量為26 kDa的TNF-α前體裂解成具有活性形式的、成熟的相對(duì)分子質(zhì)量為17 kDa的TNF-α[6]。③MMP-9通過增加彈性蛋白酶的活性而間接促使ECM及基膜的損傷。④降解肺泡毛細(xì)血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原,加重肺水腫。

MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶,通過介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解,參與正常發(fā)育、組織重建、修復(fù)、細(xì)胞遷移、血管生成、炎性反應(yīng)、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。在正常情況下,MMPs表達(dá)量很少,但活化的中性粒細(xì)胞可釋放大量的MMP-9。肺泡毛細(xì)血管基底膜的損害是以細(xì)胞外基質(zhì)的變化為基礎(chǔ)。MMP-9的過度激活和表達(dá),導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分降解,基底膜破壞,通透性增加,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),引起ARDS。Chetty等[7]也證實(shí)MMP-9參與了高氧誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷,并隨損傷的加重MMP-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)。MMP-9還可能通過降解肺組織中的彈性纖維造成肺組織彈性支持作用減低,結(jié)構(gòu)破壞;同時(shí),MMP-9降解的細(xì)胞外基質(zhì)片段對(duì)炎性細(xì)胞還有趨化作用,可放大肺組織局部的炎性反應(yīng),進(jìn)一步加重了肺實(shí)質(zhì)的毀損。Fligiel等[8]對(duì)28例ALI/ARDS患者支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行分析,結(jié)果顯示MMP-9,MMP-8,MMP-2均增高。張向峰等[9]建立小鼠高氧環(huán)境下急性肺損傷模型,RT-PCR方法證明MMP-9 mRNA在高氧引起的肺損傷中表達(dá)增多。Kim等[10]發(fā)現(xiàn)在博來霉素引起的肺損傷中發(fā)現(xiàn)肺組織和BALF中MMP-9和MMP-2均升高,MMP-9升高更明顯,早期主要起肺損傷作用,晚期肺組織中MMP-9和MMP-2也升高,起肺組織損傷修復(fù)作用,導(dǎo)致肺纖維化。劉新等[11]研究發(fā)現(xiàn),異丙酚可產(chǎn)生與抑制MMP-9活性相關(guān)的肺保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠光氣吸入性肺損傷動(dòng)物模型,證明與空氣對(duì)照組相比,光氣損傷組BALF中MMP-9及TNF-α的含量明顯增加,MMP-9在光氣染毒組中表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(P＜0.01),并隨時(shí)間延長(zhǎng),MMP-9mRNA的表達(dá)顯著增加,證明MMP-9與光氣吸入性肺損傷程度存在相關(guān)性。

MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的確切機(jī)制目前尚未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)證明MMP-9被激活后導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)和中性粒細(xì)胞活化致傷是引起ALI發(fā)生發(fā)展的共同軸心環(huán)節(jié)。通過本實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為光氣吸入性肺損傷的可能機(jī)制為:(1)光氣吸入導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞在肺部扣押,引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)。(2)激活的炎性細(xì)胞和釋放的炎性介質(zhì)使MMP-9的表達(dá)含量上調(diào),降解肺泡毛細(xì)血管基底膜,使其通透性增加,肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)顯著紊亂,肺水腫形成。(3)鈉-鉀ATP酶活力受到抑制,肺組織清除氧自由基的能力明顯下降[12]。氧化物質(zhì)大量生成能直接切斷MMP-9的cys-Zn2+間的配心暴露而激活,從而發(fā)揮其損傷作用。

MMP-9可以通過多種途徑參與光氣吸入性肺損傷,并與眾多細(xì)胞炎性因子如TNF-α之間存在正反饋,促進(jìn)炎癥進(jìn)展。在發(fā)生ALI后,早期應(yīng)用MMP-9抑制劑,如地塞米松,烏司他丁抑制MMP-9活性可能會(huì)減輕肺損傷的程度[13]。在光氣引起的肺損傷中,目前尚需相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明。通過研究細(xì)胞因子與MMP-9之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路可進(jìn)一步了解MMP-9在光氣吸入性肺損傷中的作用,同時(shí)在臨床研究中對(duì)光氣中毒患者M(jìn)MP-9進(jìn)行評(píng)價(jià),并觀察MMP-9與其相關(guān)性,以期進(jìn)一步探討光氣吸入性肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

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