保存方法和年限對黃瓜枯萎病病菌致病力的影響

張作標，柳景蘭，關(guān)鐘燕

（黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，黑龍江哈爾濱，150069）

黃瓜枯萎病為土傳病害，是黑龍江省黃瓜生產(chǎn)上的主要病害之一，尤其是對保護地生產(chǎn)的黃瓜為害更為嚴重。據(jù)文獻報道，黃瓜枯萎病在土壤中可存活5～6 a，但對于病菌在人工保存條件下存活年限及致病力情況還未見報道，本文對自1984年以來在冰箱里用不同方法保存了11～22 a的87份黃瓜枯萎病菌株進行了致病力的測定研究，旨在為長時間保存黃瓜枯萎病菌株提供些實踐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為1984-1997年保存在0℃左右的冰箱中的黃瓜枯萎病菌株，于2005-2006年隨機取樣87份，其中有74份是用試管固體PDA斜面培養(yǎng)基保存的菌株，3份為試管米飯培養(yǎng)基保存的，1份為大麥粒在大三角瓶中保存的，9份為植株的根莖在牛皮紙袋中保存的菌株。供試品種為津研4號（感病品種）， 長春密刺 （抗病品種），HF5-1，HG5-4，HG6，HG7共6個品種。

1.2 抗性評價標準

高抗（HR）：病情指數(shù) 0～10； 抗病（R）：病情指數(shù) 11～30； 中抗（MR）：病情指數(shù) 31～50； 感病 （S）：病情指數(shù) 51～70；高感（HS）：病情指數(shù) 71～100。

1.3 試驗方法

用PDA平板培養(yǎng)基將不同方法保存不同年限的菌株進行接種，培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，然后進行顯微鏡檢查，觀察菌絲體及其分生孢子生長情況，經(jīng)過分離純化培養(yǎng)，選擇部分菌株，應(yīng)用黃瓜胚芽接種方法進行致病力測定，接種濃度為1×107個分生孢子/mL和5×107個分生孢子/mL，菌株培養(yǎng)和致病力測定均在人工氣候箱中進行，溫度為28℃，相對濕度為70%，光照采用12 h照明，12 h黑暗。

菌株接種分3批進行，第1、2批均為試管、三角瓶保存的菌株，第1批于2005年12月25日接種，于12月31日至2006年1月2日陸續(xù)長出菌落；第2批于2005年12月29日接種，于2006年1月2～4日陸續(xù)長出菌落，第3批接種的是用牛皮紙袋保存的植株根莖，2006年2月7日接種，于2月10～14日分別長出菌落。

表1 不同方法保存的黃瓜枯萎病菌株接種后成活率比較

表2 保存不同年限的黃瓜枯萎病菌株成活率比較

表3 未經(jīng)回接原保存的菌株的致病力測定

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法保存的菌株成活率

從表1可以看出，在0℃左右的冰箱中以不同方法保存的黃瓜枯萎病菌株接種后成活率差異顯著，74管PDA固體斜面培養(yǎng)基保存的黃瓜枯萎病菌株有57管長出菌落，其中22管無污染，另35管有少量污染；3管米飯培養(yǎng)基保存的黃瓜枯萎病菌株全部污染，未長出菌落；在大三角瓶用大麥粒保存的1份黃瓜枯萎病菌株正常長出菌落；9份根莖保存在牛皮紙袋的黃瓜枯萎病菌株，4份污染嚴重，5份長出黃瓜枯萎病菌落。說明用試管PDA固體斜面培養(yǎng)基和在大三角瓶麥粒培養(yǎng)基保存的菌株成活率高，米飯培養(yǎng)基成活率為零，分析其原因可能是固體PDA培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基結(jié)構(gòu)緊密，表面光滑，經(jīng)消毒滅菌后不易被其他菌類污染，而米飯培養(yǎng)基結(jié)構(gòu)松散有空隙，保存期過長易產(chǎn)生細菌和霉菌所致；保存在牛皮紙袋中的植株根莖因保存時間較長，在根莖處除原有的枯萎病菌外又生長出一些其他的霉菌，因此在接種時枯萎病菌和霉菌等菌同時生長出來，而且霉菌生長速度快，枯萎病菌很難分離純化，因此成活率低。

2.2 保存不同年限的黃瓜枯萎病菌株接種后成活率比較

將用PDA固體斜面培養(yǎng)基從1984-1997年的70份黃瓜枯萎病菌株接種，接種后2～5 d長出菌落，經(jīng)鏡檢確認后，調(diào)查其成活率。

從表2可以看出，在11～22 a期間，用相同方法保存的菌株，成活率高低與年限的長短不成正比，差異不明顯；主要和當(dāng)時保存的菌株的純度、操作嚴密、封口有關(guān)，如保存最早的黃瓜枯萎病菌株是1984年，32管菌株接種后成活28管，成活率為87.5%，距2006年已經(jīng)有22 a，成活率仍很高。而1994年保存的2管菌株其成活僅為50%。說明黃瓜枯萎病菌株保存后成活率，不僅與保存年限有關(guān)，也與菌株純度、保存菌株時操作嚴密、封口等環(huán)節(jié)有關(guān)，也說明在0℃左右的冰箱條件下或許可以比22 a保存期更長。

2.3 致病力測定

①未經(jīng)回接原保存菌株的致病力測定 于2006年將分離純化的黃瓜枯萎病菌株，隨機選取05-2，05-6兩個菌株，用1×107個孢子/mL濃度接種，選取05-38和05-54兩個菌株，用5×107個分生孢子/mL濃度接種，接種的黃瓜品種為長春密刺，津研4號，HF5-1，HG5-4，HG6，HG7， 接種后放在人工氣候箱中，于2006年1月27日進行第1次發(fā)病調(diào)查，于2006年2月4日進行第2次發(fā)病調(diào)查，并計算病情指數(shù)，其致病力測定結(jié)果如下。

由表3可以看出，保存了20～22 a的黃瓜枯萎病菌株，未經(jīng)過回接，用1×107個分生孢子/mL濃度進行黃瓜胚芽接種，抗病的長春密刺病情指數(shù)達到18.7和27.5，對于感病的津研4號病情指數(shù)為55.3和56.5，用5×107個分生孢子/mL濃度進行黃瓜胚芽接種，抗病的長春密刺病情指數(shù)達到6.35和18.5，對于感病的津研4號病情指數(shù)為56.5～92.5。說明保存了20～22 a的黃瓜枯萎病菌株仍有很強的致病力。

②回接后菌株的致病力測定 為了增強菌株的致病力，將分離培養(yǎng)的菌株選擇12管，進行回接，再進行致病力測定，接種濃度為1×107個分生孢子/mL，接種時間為2006年3月4日，接種后于2006年3月20日進行第1次發(fā)病調(diào)查，3月27日進行第2次發(fā)病調(diào)查，并計算其病情指數(shù)。

表4 回接后菌株的致病力測定

從表4可以看出，回接后的12個黃瓜枯萎病菌株的致病力大大提高，感病的津研4號，其病情指數(shù)為90.00～98.30。病情評價為高感病級，而抗病的長春密刺病情指數(shù)為6.25~27.50，病情分級為高抗和抗病級。

3 小結(jié)與討論

①黃瓜枯萎病菌在試管PDA固體斜面培養(yǎng)基中保存11~22 a，經(jīng)過培養(yǎng)純化后未經(jīng)回接的原菌株進行致病力測定，用1×107個分生孢子/mL濃度，對抗病的長春密刺接種后，其病情指數(shù)可達到18.5~27.5，病情評價為抗病級；對感病的津研4號接種后，病情指數(shù)為55.3~56.5，病情評價為感病級；用5×107個分生孢子/mL濃度對抗病的長春密刺接種后，病情指數(shù)為6.35~18.5，病情評價為高抗級和抗病級；于感病的津研4號品種接種后其病情指數(shù)為56.5~92.5，病情評價為感病級和高感級。

②用保存了11~22 a的黃瓜枯萎病菌株回接后再接種，對感病的品種津研4號和抗病的長春密刺，其病情指數(shù)都很高。用1×107個分生孢子/mL接種，感病的津研4號病情指數(shù)為90.00～98.30，病情評價為高感級；對于抗病的長春密刺，其病情指數(shù)為6.25~27.50，病情評價為高抗級和抗病級。

③用米飯培養(yǎng)基保存的黃瓜枯萎病菌株污染嚴重，用試管PDA固體斜面培養(yǎng)基和大麥粒培養(yǎng)基保存的菌株有的無污染或污染輕。

④我們隨機抽取的用試管PDA固體斜面培養(yǎng)基保存的黃瓜枯萎病菌株，從1984年到1997年共70份，接種后成活數(shù)為57份，保存年限與菌株成活率不成正比，主要與保存當(dāng)時的菌株純度，操作嚴密有關(guān)。

⑤用根莖保存在牛皮紙袋中的菌株，雖培養(yǎng)后有55.5%均長出菌絲體與大小孢子，但由于污染嚴重，雖多次分離，仍有雜菌存在，這種保存方法不宜使用。

⑥因為保存的這些菌株，是在過去進行的苗期人工接種試驗時順便保存的，在試驗品種方面也是采用手頭現(xiàn)有材料，在試驗設(shè)計上還有欠缺、不完整，這些有待今后進一步完善。

⑦我們保存的菌株，最早為1984年，接種后的成活率為87.5%，由此看來，黃瓜枯萎病菌株的保存年限應(yīng)該還可以更長，這些試驗有待以后進行。