基于均勻設(shè)計法優(yōu)化紫肉甘薯高效快繁體系

顧地周 ，陳林 ，馮穎 ，姜云天

（1.通化師范學(xué)院生物系，吉林通化，134002；2.吉林省通化市靖宇中學(xué)）

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]具有產(chǎn)量高、穩(wěn)產(chǎn)性好、抗逆性強(qiáng)、用途廣等特點，是我國第四大糧食作物。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，甘薯的消費(fèi)轉(zhuǎn)向以加工和鮮薯食用為主，甘薯的科研轉(zhuǎn)向淀粉加工、優(yōu)質(zhì)食用、莖葉菜用、特用（高花青素、高胡蘿卜素、無β-淀粉酶）等專用型品種的選育與開發(fā)利用為主。紫肉甘薯因富含花青素，具獨(dú)特的色彩、食用風(fēng)味及護(hù)肝、降血糖、抗癌等保健功效，作為鮮薯食用為人們所青睞，作為原料開發(fā)的薯片、薯醬、色素等產(chǎn)品的市場前景廣闊。因其常規(guī)繁殖時萌芽少，大面積推廣栽培和應(yīng)用受到極大的限制。因此，對其進(jìn)行離體高效快繁尤為重要。通過愈傷組織再分化芽苗途徑具有增殖系數(shù)高等優(yōu)點，但仍存在外植體誘導(dǎo)愈傷組織周期較長、獲得不定芽速度較慢，且愈傷組織長期連續(xù)增殖極易發(fā)生退化和變異等缺點。而相對于愈傷組織再分化芽苗過程，腋芽增殖并同時生根途徑不僅成苗速度快，繁殖系數(shù)高，而且遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，一步成苗，大大提高了種苗生產(chǎn)效率。同時，應(yīng)用均勻設(shè)計對紫肉甘薯嫩莖的腋芽伸長生長和莖段生根條件進(jìn)行篩選，以期獲得最佳培養(yǎng)條件。目前同屬其他種植物的組織培養(yǎng)已有報道[2～3]，但關(guān)于紫肉甘薯高效快繁的報道迄今未見。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的處理

4月初，采紫肉甘薯嫩莖（引自福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的泉紫薯1號品種）在實驗室內(nèi)水培促使腋芽萌發(fā)。待腋芽萌發(fā)并長至3.0 cm時剪下，在超凈工作臺上用70%酒精涮洗60 s，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗10次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切割成一葉一段作為外植體備用[1]。

1.2 紫肉甘薯腋芽萌發(fā)生長及莖段生根培養(yǎng)基的篩選

以改良MS（1/4大量元素、1/3微量元素、1/3鐵鹽和1/3有機(jī)成分）為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖20 g/L，瓊脂粉 8.5 g/L，pH 值 5.7，溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度1 100 lx，光照周期10 h/d。待外植體嫩莖段的腋芽萌發(fā)長至2.0 cm時，將其切下后切割成一葉一段接種到附加不同濃度的IAA、IBA、NAA和 GA3的改良MS培養(yǎng)基上進(jìn)行腋芽伸長生長及生根培養(yǎng)，篩選最適宜的培養(yǎng)基。

1.3 高效快繁體系的建立

以節(jié)培法進(jìn)行快繁[2～3]，以紫肉甘薯再生植株的莖節(jié)為材料，即切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的腋芽伸長生長及生根培養(yǎng)基中進(jìn)行節(jié)增殖及生根培養(yǎng)。統(tǒng)計計算出增殖周期和倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析與處理采用均勻設(shè)計 （Uniform Design）軟件?；貧w分析均采用全回歸（后退法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良MS培養(yǎng)基中不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度交叉配比對紫肉甘薯腋芽生長及莖段生根的影響

待外植體嫩莖段的腋芽萌發(fā)后長至2.0 cm時，將其切下后切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到附加不同濃度的IAA、IBA、NAA和GA3的改良MS培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽伸長生長及生根培養(yǎng)，由預(yù)試驗可知濃度范圍分別為 IAA 0.10～0.40 mg/L，IBA 0.10～0.30 mg/L，NAA 0.07～0.12 mg/L 和 GA31.10～1.80 mg/L， 低于控制范圍的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不能促使紫肉甘薯生根和腋芽伸長生長；過高的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)導(dǎo)致幼苗基部膨脹或產(chǎn)生愈傷瘤和抑制腋芽萌發(fā)生長，繼續(xù)培養(yǎng)根從膨脹部或愈傷瘤上發(fā)出，這樣的苗在移栽時，根隨愈傷瘤從苗基部脫落，移栽成活率幾乎為零，可能是根與苗莖的纖維疏導(dǎo)組織連接不完整所致。為了提高紫肉甘薯植株再生的速度和再生率，采用均勻設(shè)計法[4～6]，每個處理 30株，選用U10（104）均勻表（表 1），同時考察了 IAA、IBA、NAA和GA3濃度交叉配比對紫肉甘薯腋芽伸長生長及生根的影響，考察再生率以腋芽伸長生長和莖段生根為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。

所得數(shù)據(jù)經(jīng)均勻設(shè)計軟件處理，得回歸方程Y=120-97.9X1+17.5X2-10.0X3-13.1X4，樣本容量 N=10，顯著性水平 α=0.01，復(fù)相關(guān)系數(shù) R=0.999 1，檢驗值 Ft=720.9，臨界值 F（0.01，4，5）=11.39，F(xiàn)t＞F（0.01，4，5），顯著，說明回歸方程有意義。對各方程項進(jìn)行顯著性檢 驗 可 知 ： 檢 驗 值 F（3）=0.671 6， 臨 界 值 F（0.01，1，5）=16.26，F(xiàn)（3）≤F（0.01，1，5），此方程項不顯著,需要剔除。剔除不顯著方程項，新建回歸方程繼續(xù)計算:得回歸方程Y=119-98.1X1+18.3X2-13.0X4，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 0，檢驗值 Ft=1 017，臨界值 F（0.01，3，6）=9.780，F(xiàn)t＞F（0.01，3，6），回歸方程顯著。 同理對各方程項進(jìn)行顯著性檢驗可知：各方程項對Y影響均顯著。根據(jù)回歸方程求出 Y的最優(yōu)組合為：X1=0.10，X2=0.30，X4=1.10，在此組合基礎(chǔ)上求得最優(yōu)解：y=100，此解為方程解析解，需按公式Y(jié)=y±Uα·s計算出優(yōu)化值區(qū)間估計為 Y=100±2.00，即 98.0%～102.0%。以最優(yōu)組合做試驗驗證，將紫肉甘薯嫩莖段接種到附加IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L的改良MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d嫩莖基部開始出現(xiàn)根錐，18 d后腋芽開始萌動生長，繼續(xù)培養(yǎng)至23 d嫩莖基部直接發(fā)出3～5條不定根（圖1a），28 d后苗高可達(dá)3.0 cm以上，有的產(chǎn)生了側(cè)根，根和苗的形態(tài)、發(fā)育均正常，再生率達(dá)99.5%以上。在估計區(qū)間范圍內(nèi)，且比所有試驗Y值都大?？梢?，紫肉甘薯腋芽萌發(fā)生長及生根的最佳培養(yǎng)基為：MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L。

表1 U10(104)因素及水平設(shè)計 mg/L

表 2 U10(104)均勻設(shè)計實驗安排及結(jié)果

2.2 高效快繁體系的建立

采取節(jié)培法進(jìn)行繼代快繁，待紫肉甘薯莖段生根的苗伸長至5.0 cm以上時，在超凈臺上打開培養(yǎng)瓶留一葉剪下苗干，將其切割成一葉一段再轉(zhuǎn)接到嫩莖段生根同時腋芽伸長生長的培養(yǎng)基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中進(jìn)行節(jié)增殖和生根培養(yǎng)。21 d為1個增殖周期，每瓶增殖倍數(shù)平均達(dá)50以上（圖1b）。

圖1 紫肉甘薯組培圖（a為外植體莖斷的初代培養(yǎng)；b為腋芽增殖及生根；c為移栽。）

2.3 煉苗和移栽

待苗根長至3.0 cm以上時，從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，在含有3 mg/L殺毒礬溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)20倍殺毒礬消毒過的腐爛松針、泥炭土和細(xì)河砂（2∶1∶1）混合的基質(zhì)中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在80%，溫度控制在（20±2）℃，每天自然光照8 h，每天中午通風(fēng)換氣15 min，7 d后揭去薄膜，每天早晚噴灑清水各1次，成活率達(dá)98%以上（圖1c）。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L對紫肉甘薯腋芽伸長生長及莖段生根的誘導(dǎo)效果顯著，IAA和IBA的同時加入促進(jìn)了莖段的生根率和生根速度，在培養(yǎng)基中添加1.10 mg/L的GA3促進(jìn)了腋芽的萌發(fā)和伸長生長；繼代快繁采取節(jié)培法，以紫肉甘薯再生植株的莖節(jié)為材料，即切割成一葉一段轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的腋芽伸長生長及生根培養(yǎng)基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中進(jìn)行節(jié)增殖和生根培養(yǎng)，遺傳穩(wěn)定性好，速度快、成苗率高，從而縮短了增殖周期，提高了增殖倍數(shù)，方法簡捷，經(jīng)濟(jì)實用，可操作性強(qiáng)，達(dá)到了快速增殖的目的。應(yīng)用均勻設(shè)計法處理和分析數(shù)據(jù)大大縮短了培養(yǎng)基配方的摸索周期。本研究已成功建立了紫肉甘薯的高效離體快繁體系，達(dá)到了預(yù)期目的；這可能對紫肉甘薯品種（系）的生產(chǎn)及工廠化育苗有一定的參考意義。

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