人骨髓間充質(zhì)干細胞的體外多向分化潛能

鄧方閣,李玉林

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力及多向分化潛能,在不同的誘導條件下,可向多種組織細胞分化[1-5]。目前,利用MSCs多向分化潛能及其可自體利用且無免疫排斥等特性,作為種子細胞用于組織工程學和基因工程學研究已成為熱點。本研究在體外分離人骨髓血,利用密度梯度離心及貼壁篩選法分離培養(yǎng)出人MSCs(human MSCs,hMSCs),分別利用3種不同的條件誘導培養(yǎng)基,誘導hMSCs向成骨細胞、脂肪細胞及心肌細胞分化,為細胞移植、組織再生修復可能的自體來源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Percoll(Pharmacia,Biotec,USA),LDMEM,HDMEM和10%胎牛血清(均Hyclone,USA),100 U/ml青鏈霉素雙抗 (華北制藥廠),0.125%～0.250%胰酶(Promega,USA),鼠抗人單克隆抗體 CD31、CD34、CD44、CD45、CD105(Neomarker,USA),地塞米松、吲哚美辛、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxan- thine,IBMX)、抗壞血酸、β2甘油磷酸鈉、阿扎胞苷(5-氮雜胞苷,5-azacitidine,5-Aza)、油紅O(Sigma,USA)。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及免疫表型檢測 方法同文獻[6]所述,在無菌狀態(tài)下取自愿捐獻者的肝素化的穿刺骨髓血3～5 ml,利用Percoll(比重為1.073 g·ml-1)密度梯度離心,抽取單個核細胞層,用含青鏈霉素雙抗(100 U/ml)的10%胎牛血清的L-DMEM 重懸細胞,計數(shù)以(3～4)×106的細胞密度接種在6孔板中進行培養(yǎng)。接種后3 d首次換液,每隔3～4 d換液一次。當原代細胞接近匯流(＞80%融合)時,0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的傳代hMSCs用于后續(xù)研究。胰酶消化收集細胞,1×106個/mL細胞與一抗單克隆抗體 CD31 、CD34、CD44、CD45、CD105 孵育液常溫下孵育30～40 min。PBS洗滌2次后與FITC標記的二抗4℃避光孵育20～30 min。PBS沖洗2次后加500 μ l PBS重懸細胞,用于流式細胞儀分析。

1.3 人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞、脂肪細胞的誘導分化 取生長狀態(tài)良好的傳代hMSCs,以2×105個/cm2密度接種于置有處理過的蓋玻片的24孔板中,當細胞融合達到60%～70%時,更換為成骨誘導培養(yǎng)基(地塞米松1μ mol/L,β2甘油磷酸鈉 10 mmol/L,抗壞血酸 50 μ mol/L)、成脂誘導培養(yǎng)基(地塞米松1 μ mol/L,吲哚美辛0.2 mmol/L,胰島素10 mg/L,IBMX 0.5 mmol/L),每隔3 d更換培養(yǎng)液1次,繼續(xù)誘導14 d后固定細胞,進行堿性磷酸酶染色檢測或油紅O染色檢測。

1.4 人骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的誘導分化取生長狀態(tài)良好的傳代hMSCs以2×105個/cm2密度接種于置有處理過的蓋玻片的24孔板中,當細胞融合達到 60%～70%時,更換成 1%FBS的HDMEM饑餓培養(yǎng)24 h,后換成心肌細胞誘導培養(yǎng)基(5-Aza,10 μ mol/L)孵育 24 h,再換成不含誘導劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d,細胞固定,進行PTAH染色。

2 結(jié) 果

2.1 人骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學特征及免疫表型 接種的骨髓單個核細胞,3 d后逐漸貼壁生長,經(jīng)2～3次完全換液后,貼壁生長的細胞形態(tài)均一,呈長梭形。培養(yǎng)至10～18 d,細胞出現(xiàn)80%～90%的融合。傳代后的hMSCs形態(tài)上更加趨于一致,均為緊密排列的成纖維細胞樣細胞(圖1)。流式細胞檢測表明,hMSCs表達CD44、CD105,不表達血管內(nèi)皮細胞標志CD31、造血干細胞標志CD34和白細胞表面抗原CD45。表型檢測參見前期實驗論文[5]。

圖1 傳代后的hMSCs(HE ×200)

2.2 多向分化潛能的鑒定

2.2.1 成骨誘導 細胞在成骨誘導體系中培養(yǎng)4～5 d,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞由原來的成纖維細胞樣變?yōu)槎嘟切?誘導1周,80%以上的細胞為不規(guī)則形,誘導2周,細胞間相互融合,并形成散在的細胞結(jié)節(jié)。堿性磷酸酶染色顯示,聚集成的結(jié)節(jié)區(qū)呈棕黑色,表明此結(jié)節(jié)為鈣鹽沉積(圖2)。

圖2 hMSCs分化為成骨細胞(堿性磷酸酶染色 ×250)

2.2.2 成脂肪誘導 hMSCs在成脂肪誘導體系中培養(yǎng)3d,細胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴,細胞形態(tài)也逐漸由成纖維樣細胞變?yōu)榘w增寬的短梭形、圓形或多角形,培養(yǎng)2周時,細胞內(nèi)的脂滴增大,并相互融合。油紅O染色顯示,細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,脂滴被特染成紅色,與油紅O染色陽性對照的人脂肪細胞相似,表明成脂分化的hMSCs在細胞化學特性上已具有與人脂肪細胞相似的細胞化學特性(圖3)。

圖3 hMSCs分化為脂肪細胞(油紅O染色 ×200)

2.2.3 成心肌誘導 細胞經(jīng)5-Aza誘導1周,細胞變化并不明顯,部分細胞變長或變寬大;誘導2周,細胞逐漸由長梭型變成多爪型或星型。PTAH染色顯示,經(jīng)5-Aza誘導后的細胞,胞漿呈藍色。通過與SD乳鼠心肌細胞 PTAH染色相比較,提示成心肌細胞分化的hMSCs在細胞化學特性上具有與 SD乳鼠心肌細胞相似的細胞化學特性(圖 4)。

3 討 論

組織器官移植可能是人類攻克某些重大疾患如心腦血管疾病、癌癥、老年性疾病等的根本措施。正因為這些取自人胚胎或骨髓的具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體的干細胞,可用于培育不同的人體細胞、組織或器官,有望成為移植器官的新來源。但是,由于胚胎干細胞在倫理道德等方面的制約而備受爭議,因此骨髓來源的干細胞越來越受到廣泛關(guān)注。

圖4 成心肌誘導后的hMSCs分化為心肌細胞(PTAH染色 ×200)

目前,普遍認為,在骨髓中至少存在兩種干細胞群,即造血干細胞和MSCs。MSCs是中胚層發(fā)育的早期細胞,可通過體外貼壁培養(yǎng)加以分離,不僅能分化為造血實質(zhì)和基質(zhì)細胞等,還分化為多種造血以外的組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織的細胞[1-5]。隨著干細胞工程及其相關(guān)生物技術(shù)研究發(fā)展,以及對干細胞本身特有的特性認識,使得研究者在體外培養(yǎng)動物MSCs,體外定向誘導分化為所需的不同細胞,同時體內(nèi)動物實驗也已成功證實MSCs的修復作用,如在鼠的慢性肢體缺血模型中,MSCs參與血管形成,表達內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞標志[7];將MSCs移植入鼠的心肌梗死區(qū),可分化成心肌細胞,充填梗死病灶,并與心肌細胞形成縫隙連接,誘導血管新生,從而形成了有功能的心肌組織[8-9];將體外擴增的MSCs裝入擴散小室(多孔陶瓷或陶瓷柱)后再移植入動物體內(nèi),擴散小室內(nèi)的MSCs能夠利用宿主動物體內(nèi)的營養(yǎng)合成骨和軟骨[10];將建系的鼠胚胎干細胞[11]或少量部分分化的胚胎干細胞形成的胚體細胞[12]植入帕金森病小鼠,可分化為多巴胺神經(jīng)元。從理論上來說,由于使用的是來自患者自身組織培養(yǎng)擴增的治療用細胞,因此移植時患者體內(nèi)不會產(chǎn)生免疫排斥反應。此外,干細胞可無限高度增殖,在數(shù)量上以保證治療的需要,從而解決了可供移植細胞、組織或器官嚴重不足的問題。隨著整體社會的老年化,每年都有數(shù)以百計的患者需要進行修復或移植,干細胞工程及其相關(guān)生物技術(shù)研究將可能解決這些問題,為人類的健康與長壽帶來新的希望。

迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)MSCs的特異性表面標志[2-3],因而缺乏直接的鑒定方法。目前判斷體外培養(yǎng)的MSCs主要采用聯(lián)合鑒定方法[1-4]:(1)體外分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)為均一的梭形、紡錘狀或成纖維細胞樣的細胞;(2)SH2(CD105)、CD44等呈陽性表達,而CD31、CD34、CD45等呈陰性表達;(3)在不同誘導條件下可向多系定向分化。多向分化潛能和自我更新是干細胞的基本特點。因此,在本研究中,利用密度梯度離心及貼壁篩選法分離人骨髓血,培養(yǎng)出形態(tài)為成纖維樣、梭形的細胞;經(jīng)免疫細胞化學檢測,表達CD44和CD105,不表達造血干細胞標志CD34和白細胞表面抗原CD45。經(jīng)不同的誘導條件培養(yǎng)基誘導,可分別分化成成骨細胞、脂肪細胞和心肌細胞。上述的實驗結(jié)果完全符合目前所定義的體外培養(yǎng)的MSCs主要采用聯(lián)合鑒定方法,從而證實人骨髓中的MSCs易于體外分離培養(yǎng),且具有多向分化潛能,在不同的誘導體系下能分化成不同類型的組織細胞,可為骨組織工程學、心肌組織再生醫(yī)學中損傷組織的修復與治療提供自體來源細胞。

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