舟山野菊花序不同萃取物抑菌活性的研究

童國忠，馬劍茵，石亞素，王 斌

（1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.舟山市定海區(qū)疾病控制中心，浙江舟山 316000）

野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicum、北野菊Chrysanthemum boreale Mak.或巖香菊Chrysanthemum lavandulaefolium(Fisch.)Mak.的頭狀花序[1]，性涼，味苦、辛，歸肺肝經(jīng)，具有疏風(fēng)清熱、消腫解毒的功效，主治風(fēng)熱感冒、高血壓、肺炎、口瘡、癰癤等?，F(xiàn)代藥理證明：野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、清除活性氧自由基等作用[2]。舟山野菊花資源非常豐富，但開發(fā)利用甚少。本研究選擇舟山群島野菊花的頭狀花序經(jīng)微波乙醇提取得粗提物[3]，通過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取得到4種分段部位，并對4種萃取部位首次進(jìn)行臨床常見致病菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果將為舟山群島抗感染中草藥的開發(fā)和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野菊花采自浙江省舟山市定海區(qū)馬岙鎮(zhèn)，鑒定為菊科Compositae菊屬Dendranthema多年生草本植物野菊。樣品去除雜質(zhì)，取頭狀花序，自然風(fēng)干，使用前45℃烘干、粉碎至40目，得野菊花粗粉，保存于干燥器中。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus，ATCC-26003；大腸埃希氏菌Escherichia coli，ATCC-44102。臨床分離菌株：大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，均由舟山市定海區(qū)疾控中心提供。

營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號 090605，090521）；藥敏紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）；其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

微波催化合成/萃取儀（XH-100A型，北京祥鵠科技有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-2型，廣東省醫(yī)療器械廠）；高速藥物粉碎機(jī)（WK-800A型，青州市精誠機(jī)械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 供試藥制備

1.3.1 樣品提取與分段

稱取樣品50 g加70%乙醇浸泡12 h后微波萃?。ㄎ锪媳?：40，功率800 W，溫度50℃，萃取時間15 min），抽濾，重復(fù)3次合并濾液，減壓濃縮得干浸膏。將浸膏用水懸浮分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，減壓濃縮得萃取物A（石油醚）、B（乙酸乙酯）、C（正丁醇）和D（水）4部分，計算各萃取物產(chǎn)率。

1.3.2 藥液制備

將各萃取物用滅菌蒸餾水（用5%二甲基亞砜助溶）溶解配制成供試藥液，分別將質(zhì)量濃度調(diào)整為相當(dāng)于生藥1 g/mL，經(jīng)115℃高壓滅菌20 min后，于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌種活化及菌懸液制備

菌種活化：將供試菌種在相應(yīng)平板上分離后，接種到試管營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，每種菌株接種2支試管，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，于冰箱4℃保存供測試用。

菌懸液制備：將營養(yǎng)瓊脂斜面活化的菌種用無菌生理鹽水制成約1.0×109CFU/mL的菌懸液，同時用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.5 抑菌試驗(yàn)[4]

1.5.1 瓊脂平板孔穴法（K-B法）

抑菌圈直徑作為藥物敏感初篩。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌等4種菌懸液各5 mL分別倒入150 mL融化且冷卻至45～50℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中充分搖勻，迅速分裝于培養(yǎng)皿（Φ 90 mm）中，培養(yǎng)基厚約5 mm，待凝固后，在瓊脂平板上打4個對稱且直徑為6 mm的小孔，分別在每個小孔內(nèi)注入0.2 mL各種提取液，每個菌種做3個平行樣本。置于37℃恒溫培箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑（以完全不生長菌作為測量標(biāo)準(zhǔn)），以各產(chǎn)物對測試菌3次平均值為抑菌圈直徑，抑菌圈大于10 mm為抑菌敏感，小于8 mm或無抑菌圈為抑菌不敏感。

1.5.2 耐藥菌種敏感測試

瓊脂平板同“1.5.1”項(xiàng)制作。臨床分離的耐藥菌敏感測試按照抗生素藥敏常規(guī)測試方法（紙片法）進(jìn)行[5]。

1.5.3 最低抑菌濃度（MIC）測定

采用試管倍比稀釋法[6]測定MIC。取無菌試管12支，在第1、2管中分別加入各萃取藥液0.5 mL，在第2管至第10管分別加人營養(yǎng)肉湯0.5 mL，用1 mL滅菌吸管從第2管開始管內(nèi)倍比稀釋藥液至第10管，充分混勻后從第10管中棄去0.5 mL。第11管加營養(yǎng)肉湯1.5 mL，第1管至10管分別各加營養(yǎng)肉湯1.0 ml，第12管加2.0 mL；第1至11管各加菌懸液0.5 mL。第11管不加藥液為陽性對照，第12管只加2.0 mL營養(yǎng)肉湯為陰性對照。充分混勻放置37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h。

MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)：37℃培養(yǎng)18～20 h后首先在觀察陽性對照管長菌呈渾濁狀，而陰性對照管不長菌、呈透明狀的前提下，再觀察其他試管的渾濁情況，以判斷不同濃度藥液的抑菌作用，如試管內(nèi)呈渾濁，證明有細(xì)菌生長，用“+”表示；如試管內(nèi)澄清透明，證明無菌生長，用“-”表示。以肉眼觀不渾濁試管的最低藥物濃度作為該藥的MIC；若藥液色素太深，從中取一環(huán)接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)后再進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥菌藥物敏感試驗(yàn)

從表1結(jié)果來看，分離的大腸埃希菌不僅對臨床常用的慶大霉素、諾氟沙星、阿莫西林產(chǎn)生耐藥性，而且對近年應(yīng)用于臨床的氨曲南、環(huán)丙沙星等抗菌藥物也呈現(xiàn)出耐藥性。金黃色葡萄球菌多重耐藥現(xiàn)象更為明顯，所試藥物中僅對萬古霉素、頭孢哌酮、亞胺培南敏感。

2.2 不同萃取物對產(chǎn)率的影響

依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取，分別減壓濃縮各萃取物及萃余水相得4種萃取物。各萃取物產(chǎn)率水層（D）為最高，達(dá) 2.18%，正丁醇（C）、乙酸乙酯（B）、石油醚（A）分別為 1.55%、1.32%、0.98%，結(jié)果見表2。

2.3 抑菌圈直徑藥敏初篩

由表3可知，水相對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)、耐藥菌的抑菌圈直徑分別為15.4 mm和16.5 mm，對大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)菌、耐藥菌抑菌圈直徑分別為14.2 mm和13.6 mm，表明抑菌效果顯著。正丁醇相抑菌圈直徑在10～12.8 mm之間，也有較強(qiáng)的抑菌作用。乙酸乙酯和石油醚抑菌圈直徑小于10 mm，尤其是石油醚抗菌作用不明顯，結(jié)果見表3。

2.4 萃取物MIC值測定

從表3中可以看出除石油醚萃取物外，其余3種萃取物對抑菌圈直徑＞8 mm，進(jìn)一步作最低抑菌濃度測定。萃余水相對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌、耐藥菌株的MIC分別為7.81、15.62、3.90、1.95 mg/mL。正丁醇相MIC除大腸埃希菌耐藥菌為31.25 mg/mL外，其余均為15.62 mg/mL。乙酸乙酯MIC值低，僅顯示微弱或無抑菌作用。MIC值與其相應(yīng)抑菌圈大小的成一定的平行關(guān)系，結(jié)果見表4。

表1 2種臨床分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Drugs resistant analysis of S.aureus and E.coli

表2 舟山野菊花不同萃取物產(chǎn)率Tab.2 Productivty of extraction in the inflorescence of C.indicum

表3 舟山野菊花不同萃取物的抑菌圈直徑（mm）Tab.3 Antimicrobial zone diameter of four extracts in the inflorescence of C.indicum

表4 舟山野菊花3種萃取物對細(xì)菌的MIC(mg·mL-1)Tab.4 MIC of three extract in the inflorescence of C.indicum

4 討論

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，人類誤用、濫用抗菌藥物的弊端也日益顯現(xiàn)出來，不少細(xì)菌的耐藥性正在逐年增加，尤其是大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌對抗生素及其它化學(xué)合成抗感染藥的耐藥性非常顯著[7-8]，已成為臨床最常見的感染病原之一，值得引起臨床高度重視。本實(shí)驗(yàn)對臨床分離的2株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，呈現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象。

野菊花在中國民間有廣泛用途，其對病原菌的抑制作用亦有報道[9]。本文對資源非常豐富，但開發(fā)利用甚少的舟山群島野菊花，用不同極性的溶劑梯度分配萃取物首次進(jìn)行抑菌研究。研究結(jié)果表明，舟山野菊花水、正丁醇相萃取物不僅對革蘭氏陰性的大腸埃希菌、革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌，而且對標(biāo)準(zhǔn)菌或耐藥菌株都有較強(qiáng)的抑制作用。顯示出抗菌作用強(qiáng)、抗菌譜較廣、抗耐藥性的特點(diǎn)。

從表3、4抑菌圈直徑大小及MIC高低來看，抑菌效果顯著的為產(chǎn)物C、D，產(chǎn)物B雖表現(xiàn)出一定的抗菌作用，但不是舟山野菊花主要抗菌活性成分。不同的溶劑可以提取出不同的抑菌活性物質(zhì)，其抑菌效果也有差別。從本研究提取產(chǎn)物的溶劑組別研究來看，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇極性順序由小到大，從而得到不同極性的提取物。水相抑菌活性＞正丁醇＞乙酸乙酯相，抑菌活性與溶劑極性成正比，依據(jù)“相似相溶”規(guī)律，提示野菊花抑菌活性成分可能易溶解于極性強(qiáng)的溶劑中有關(guān)。據(jù)報道野菊花抑菌活性其主要為綠原酸、鞣質(zhì)等，其中綠原酸是主要活性成分[10]。但關(guān)于野菊花抑菌機(jī)制研究較少，尚缺乏系統(tǒng)性、全面性，尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為舟山群島野菊花開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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