單克隆抗體技術(shù)在畜禽疾病診斷中的應(yīng)用

吳芷靜

（遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與行政執(zhí)法中心 110000）

1975 年，Kohler 和Milstein 通過(guò)細(xì)胞雜交技術(shù)，利用綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤株，并成功制備出抗綿羊紅細(xì)胞的單克隆抗體，由此發(fā)現(xiàn)了可產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)，雜交瘤細(xì)胞具有單一的特異性抗原識(shí)別位點(diǎn)，具有小鼠淋巴細(xì)胞的特性和骨髓瘤細(xì)胞持續(xù)增殖的能力[1]。單克隆抗體的識(shí)別性專一，只針對(duì)特定的抗原決定簇反應(yīng)，大大提高了敏感性。雜交瘤細(xì)胞表達(dá)的是針對(duì)淋巴細(xì)胞的特異性抗體，以及其在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞的永生特征。重要的是，雜交瘤是單克隆的，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞起源于一個(gè)細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞可注射到組織相容性小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水細(xì)胞腫瘤，此方法成為高濃度單克隆抗體的來(lái)源，通過(guò)此方法產(chǎn)生的單克隆抗體可以在液氮中無(wú)限期冷凍，需要細(xì)胞時(shí)可以隨時(shí)解凍并重新培養(yǎng)，繼續(xù)生產(chǎn)相同的特異性抗體，產(chǎn)生的特異性抗體不會(huì)因批號(hào)不同產(chǎn)生差異，有利于診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)化，也便于制備試劑盒。相對(duì)于其他生物學(xué)診斷方法，畜禽疾病診斷中單克隆抗體診斷技術(shù)具有更加特異、靈敏、成本更低的優(yōu)點(diǎn)，而且隨著生物技術(shù)手段的提高，單克隆抗體更易于生產(chǎn)出商品化的診斷試劑，目前膠體金試紙條的應(yīng)用使得畜禽疾病診斷更加快速便捷。因此，單克隆抗體診斷方法具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。

1 單克隆抗體的一般應(yīng)用

單克隆抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一般用于鑒定蛋白質(zhì)、碳水化合物和核酸等大分子物質(zhì)。如今單克隆抗體可以用于細(xì)胞復(fù)制和分化領(lǐng)域，大大提高了我們對(duì)分子結(jié)構(gòu)和功能之間的了解，在基礎(chǔ)生物科學(xué)方面，提高了我們對(duì)宿主抵抗傳染病和器官移植排斥反應(yīng)的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也提高了人們對(duì)自發(fā)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（腫瘤）及內(nèi)源性抗原（參與自身免疫）的認(rèn)識(shí)。

在獸醫(yī)學(xué)中，單克隆抗體主要應(yīng)用于3 個(gè)方面，即（1）免疫診斷試劑，直接作為證明病原體或間接用作血清學(xué)抗原致病因子的檢測(cè)；（2）用于抗原表位的分子解析及疫苗的單克隆抗體的保護(hù)性免疫實(shí)驗(yàn)；（3）用于傳染性疾病的免疫治療方面或可作為定位和靶向腫瘤的工具[2]。

2 單克隆抗體在家畜疾病診斷中的應(yīng)用

2.1 使用單克隆抗體診斷微生物疾病

布魯氏菌?。ú疾。┦怯刹剪斒暇鸬囊园l(fā)熱和流產(chǎn)為特征的人獸共患病，威脅著人類和多種動(dòng)物的生命安全，對(duì)畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。牛布魯氏菌病會(huì)導(dǎo)致懷孕后期的母牛流產(chǎn)，飲用感染牛乳汁的人群會(huì)感染該病。接種過(guò)疫苗的奶?？赡鼙辉\斷為布病是因?yàn)槌Ｒ?guī)診斷方法無(wú)法區(qū)分病原微生物和由致病微生物制成的疫苗。單克隆抗體診斷法能高效、特異的檢測(cè)出感染和免疫動(dòng)物，使用該法可在發(fā)生疫情時(shí)快速隔離感染動(dòng)物，減緩疫情的蔓延。單克隆抗體作為免疫組化法的抗體可以鑒別牛布魯氏菌脂多糖表位：光滑菌株的A 和M 表位、粗糙菌株的R1 和R2 表位[4]。如今競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)法是一種成熟穩(wěn)定的檢測(cè)方法。將布氏菌抗原固定在酶標(biāo)板后，待測(cè)血清和針對(duì)抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行共培養(yǎng)，當(dāng)待檢樣品沒(méi)有結(jié)合其他抗體時(shí)才能檢測(cè)到單克隆抗體與酶標(biāo)記抗原的結(jié)合，極大地提高檢測(cè)效率。

副結(jié)核?。∕AP）又稱約內(nèi)氏病，是一種由副結(jié)核分枝桿菌引起的以慢性增生性腸炎為特征的傳染性疾病。副結(jié)核病給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前已產(chǎn)生對(duì)副結(jié)核桿菌分泌的重要蛋白即Ag85 復(fù)合物高度特異的單克隆抗體，單克隆抗體法與ELISA 法、糞便檢查法相比具有較高的靈敏度和特異性，基于此法建立了血清庫(kù)，可以快捷的區(qū)分MAP 陽(yáng)性牛和陰性牛。

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體所引起的一種急性全身性感染性疾病，鼠類和豬是兩大主要傳染源，畜禽出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、不孕及產(chǎn)奶量減少等癥狀。目前已經(jīng)報(bào)道了命名為M553 的鼠單克隆抗體，M553 單克隆抗體可與伯氏鉤端螺旋體等螺旋體的表位共同抗原結(jié)合。與顯微凝集試驗(yàn)(Matt) 相比，單抗-競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)法（cELISA）具有更好的應(yīng)用價(jià)值[6]。

牛傳染性胸膜肺炎（CBPP）是由絲狀支原體引起的牛的一種高度接觸性傳染性疾病。Ayling 等(1998) 發(fā)現(xiàn)了M92/20單抗的間接免疫組化法(IHC) 診斷疑似感染CBPP 的病例的方法[7]。使用間接免疫組化法檢查11 只感染CBPP 的牛肺，能檢測(cè)到所有感染病例。這表明M 92/20 單抗的間接免疫組化檢測(cè)法具有高靈敏度。

2.2 用于檢測(cè)抗禽流感病毒的抗體

目前急需加強(qiáng)病毒感染診斷研究，建立國(guó)際病毒基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，方便診斷和遏制病毒性疾病在全球的蔓延。在病毒感染檢測(cè)方面，單克隆抗體的診斷發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

口蹄疫（FMD）是豬、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄動(dòng)物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，并被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A 類傳染病之首[8]。被公認(rèn)為是十六世紀(jì)以來(lái)威脅養(yǎng)牛業(yè)的重大疾病之一，在印度，每年約有5000 起疫情，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采用單克隆抗體高效快速診斷口蹄疫疫情可以減少畜牧業(yè)損失。單克隆抗體的流行診斷裝置（LFD）對(duì)7 種FMDV 血清型反應(yīng)，能快速診斷不同血清型的口蹄疫，為早期實(shí)施控制措施預(yù)留時(shí)間，減少FMD 的快速傳播。在目前臨床診斷上，針對(duì)FMD 已開(kāi)發(fā)出快速色譜條測(cè)試。另外，臨床上還開(kāi)發(fā)了基于單克隆抗體技術(shù)的膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法，試紙法可以在野外簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)A 型口蹄疫病毒，具有較高的靈敏度和特異性[9]。

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛皰疹病毒1（BoHV-1）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。該病以高熱、呼吸困難、鼻炎、竇炎和上呼吸道炎癥為特征[10]。通過(guò)BoHV-1單克隆抗體中和病毒上清液可以用于鑒定牛傳染性鼻氣管炎。

藍(lán)舌病毒（BTV）屬于呼腸弧病毒科中環(huán)狀病毒，目前已被廣泛研究。從病毒血清分組看，存在于BTV 病毒核衣殼外層的VP2 蛋白質(zhì)參與病毒復(fù)制，是藍(lán)舌病毒重要的組成部分。目前已經(jīng)生產(chǎn)了幾種單克隆抗體來(lái)鑒定VP2 蛋白上的特異性表位[11]。此外，存在少量病毒外層中的VP7 蛋白可從病毒外表面獲得，并且可靶向檢測(cè)BTV。

狂犬病是一種是由狂犬病病毒引起的、影響溫血?jiǎng)游锏募毙圆《拘阅X脊髓炎。盡管狂犬病病毒糖蛋白上抗原位點(diǎn)的數(shù)量隨時(shí)間推移而有規(guī)律的增加，早期試驗(yàn)可以根據(jù)中和抗性變異狂犬病毒的分組確定至少3 個(gè)功能獨(dú)立的抗原位點(diǎn)。但Benmansour[12]等通過(guò)使用250 多個(gè)新分離的單克隆抗體對(duì)H-2d 單體型小鼠中蛋白質(zhì)抗原性進(jìn)行了特異性檢測(cè)。

2.3 用于診斷寄生蟲(chóng)病

旋毛蟲(chóng)病是在動(dòng)物與人之間傳播的人獸共患病[13]。單克隆抗體在旋毛蟲(chóng)病早期診斷中極具意義，基于IgY（蛋黃免疫球蛋白）和針對(duì)排泄分泌抗原（IgM 型）的抗旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的單抗-夾心ELISA 法已經(jīng)用于檢測(cè)血清中的循環(huán)抗原（CAg），該方法使用雞抗體IgY 作為捕獲抗體和小鼠單克隆抗體35B9 作為檢測(cè)抗體，能檢測(cè)到加入正常小鼠血清中濃度低至1ng/ml的排泄分泌抗原，顯示出高靈敏度。此外，它對(duì)旋毛蟲(chóng)病的早期診斷和療效評(píng)價(jià)具有一定的應(yīng)用價(jià)值，這種以IgM 為基礎(chǔ)的單克隆抗體檢測(cè)可以作為檢測(cè)旋毛蟲(chóng)抗體的補(bǔ)充方法[14]。

錐蟲(chóng)病是由錐蟲(chóng)感染所致的原蟲(chóng)感染性疾病，該病在家畜中普遍存在、分布廣泛，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列出的疾病之一。針對(duì)布氏錐蟲(chóng)，剛果錐蟲(chóng)、伊氏錐蟲(chóng)開(kāi)發(fā)的特異性單克隆抗體可用于間接ELISA 中的特定抗原分離和純化。

利什曼原蟲(chóng)屬的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起一系列的疾?。簭酿つてつw利什曼病到致命的利什曼病（VL）。不同種類利什曼原蟲(chóng)特異性的單克隆抗體已被用于診斷利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株。目前單克隆抗體可以分離并純化利什曼病抗原。針對(duì)印度杜氏利什曼原蟲(chóng)的致病性前鞭毛體產(chǎn)生的單克隆抗體已用于免疫親和純化利什曼原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體和前鞭毛體中的78kDa 膜蛋白和識(shí)別子代利什曼原蟲(chóng)的57kDa 抗原[15]。

惡性瘧原蟲(chóng)入侵紅細(xì)胞需要運(yùn)動(dòng)連接的形成：運(yùn)動(dòng)連接復(fù)合物由在瘧原蟲(chóng)表面的微線體蛋白（AMA）和瘧原蟲(chóng)釋放后識(shí)別，并嵌入到宿主細(xì)胞膜的棒狀體頸蛋白（RONs），該復(fù)合物以AMA1-RON2 為骨架。PfAMA1 的結(jié)構(gòu)研究表明，其在頂端存在保守的疏水區(qū)，協(xié)調(diào)RON2 和入侵的抑制肽。單克隆抗體與AMA1 疏水區(qū)特異結(jié)合后阻止運(yùn)動(dòng)連接的形成和誘導(dǎo)納蟲(chóng)空泡的形成。根據(jù)結(jié)合在AMA1 疏水區(qū)附近的單克隆抗體，可以鑒定RON2 的結(jié)合位點(diǎn)，為潛在瘧疾疫苗提供新的靶點(diǎn)[16]。

3 結(jié)論

生物技術(shù)的進(jìn)步有利于單克隆抗體的大規(guī)模批量生產(chǎn)，單克隆抗體可運(yùn)用于多種疾病臨床診斷，如使用免疫熒光和ELISA 等方法檢測(cè)感染性病原體、抗原或?qū)乖腥井a(chǎn)生的抗體。本綜述中討論的許多重要牲畜禽疾病的診斷方法將方便診斷人員和研究人員加強(qiáng)對(duì)疾病快速診斷的認(rèn)識(shí)，為控制疾病提供更多、更好的選擇。