安全劑AD－67保護(hù)玉米免受單嘧磺隆藥害的作用及其機(jī)理

葉 非， 付 穎＊， 徐偉鈞， 王 爽

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，哈爾濱 150086）

磺酰脲類除草劑是目前世界上最大的一類除草劑，它作用于植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶（ALS），通過植物的根、葉吸收，在植物體內(nèi)雙向傳導(dǎo)。由于ALS被抑制，支鏈氨基酸的合成受到阻礙，細(xì)胞的分裂被抑制，從而導(dǎo)致雜草的正常生長受到破壞而死亡［1］。目前有關(guān)磺酰脲類除草劑的專利有400多項(xiàng)，已商品化的有30多種。這類除草劑具有很高的除草效果，用量為2～100g／hm2，比傳統(tǒng)除草劑的除草效果高100～1 000倍［2］。隨著磺酰脲類除草劑的開發(fā)和廣泛應(yīng)用，一些品種對后茬作物的長殘留藥害問題以及除草劑殘留物引起的環(huán)境問題、雜草的抗藥性及藥害等問題亦引起了人們的重視［3］。單嘧磺?。∟－（2’－（4’－甲基）嘧啶基）2硝基苯磺酰脲）屬于磺酰脲類除草劑，是我國第一個(gè)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的農(nóng)藥品種，它主要用于防治小麥田里播娘蒿、薺菜、麥瓶草等雜草，尤其對華北地區(qū)的難治雜草堿茅防效很好［4－5］。單嘧磺隆與酰胺類或三嗪類除草劑適量混用，用于夏玉米苗后莖葉處理，對馬唐、稗草、反枝莧、藜、馬齒莧等玉米田常見雜草均可有效防除。范志金等研究表明：單嘧磺隆作用靶標(biāo)是乙酰乳酸合成酶，對不同玉米品種ALS活性的影響存在差異［6］。但是，單嘧磺隆易受氣候和土壤因素的影響而不利于其降解，造成在土壤中殘留與蓄積，并對下茬敏感作物和蔬菜產(chǎn)生藥害。

除草劑安全劑又稱除草劑解毒劑或稱作物安全劑，它可以在不影響除草劑對靶標(biāo)雜草活性的前提下有選擇地保護(hù)作物免遭除草劑的藥害，還可以用于初步解釋除草劑作用靶標(biāo)和作用機(jī)制［7］。近年來，隨著生物化學(xué)領(lǐng)域分離、純化等技術(shù)的快速發(fā)展和提高，國內(nèi)外學(xué)者不僅從安全劑對作物的吸收、傳導(dǎo)影響方面，而且從安全劑對作物體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶（GSTs）和及除草劑靶標(biāo)酶的影響等方面進(jìn)行了研究，以揭示安全劑作用的本質(zhì)［8］。除草劑安全劑AD－67屬于二氯乙酰基噁唑烷類化合物，可使玉米免受硫代氨基甲酸酯類和酰胺類除草劑的藥害，增加GSH的含量，提高GST的活性［9］，但對單嘧磺隆保護(hù)玉米的作用，目前國內(nèi)外尚無報(bào)道。作者通過生物測定方法測定了AD－67對玉米的保護(hù)作用，并對玉米體內(nèi)除草劑靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性和GSH進(jìn)行了研究，初步探討AD－67保護(hù)玉米免受單嘧磺隆藥害的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：10%單嘧磺隆可濕性粉劑，南開大學(xué)元素有機(jī)所提供；安全劑AD－67，本課題組合成；TCA（三氯乙酸），北京順義永遂化工廠；DTNB（5，5－二硫代雙乙硝基甲酸）、TPP（硫胺素焦磷酸）、DTT（二硫代蘇糖酸醇）、谷胱甘肽（GSH），Sigma公司產(chǎn)品。

供試玉米品種：東農(nóng)248，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

試驗(yàn)土壤：取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田，1～15cm無污染的耕層土壤，過篩、自然風(fēng)干后使用。土壤pH為7.37，有機(jī)質(zhì)含量為2.37%。

1.2 方法

1.2.1 AD－67對單嘧磺隆解毒效果試驗(yàn)

取定量過2mm篩的風(fēng)干土，加入單嘧磺隆，配制成0、0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg的毒土，裝入小紙杯內(nèi)，平衡12h。

將精選的玉米種子用50℃左右的溫水浸泡30min，12%的H2O2浸泡10min，用蒸餾水沖洗干凈，再用不同濃度的 AD－67溶液（0、0.5、1、5mg／kg和10mg／kg）浸種12h左右，用蒸餾水清洗干凈，放在培養(yǎng)箱內(nèi)，26.5℃催芽24h左右（玉米芽長約1mm）。

選擇芽長一致的玉米種子8粒，均勻擺放在藥土表面，上覆藥土1cm左右，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（溫度26.5℃、濕度75%、光照與黑暗各12h循環(huán)培養(yǎng)），玉米生長6d后，測玉米幼苗的主根長、根鮮重、株高、株鮮重。各處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SAS系統(tǒng)進(jìn)行處理，進(jìn)行方差分析。

1.2.2 GSH 含量的測定［10］

取玉米幼苗的葉片0.5g，加2.0mL 15%的TCA，在0～4℃下研磨，再加1.0mL 15%的TCA沖洗，放入離心管中離心（12 000r／min）20min，取1mL離心后的上清液放入試管，加2.0mL的磷酸緩沖 液 （0.5mol／L，pH ＝8），加 入 0.025mL 10mmol／L的DTNB顯色，在412nm下測定A值。

1.2.3 ALS的提取和活性測定［11］

ALS的提取：取玉米幼苗的根部1.0g，加入3.0mL ALS酶提取液（0.05mol／L，pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，內(nèi)含1mmol／L的丙酮酸鈉，0.5mmol／L MgCl2，0.5mmol／L的 TPP，10μmol／L的 FAD），在0～4℃溫度條件下研磨，轉(zhuǎn)入離心管以石英砂調(diào)平衡后25 000g離心20min，取上清液2.0mL，用提取液定容至5.0mL。緩慢加入（NH4）2SO4粉末1.5g，振蕩均勻。0℃下沉降2h后，25 000g、4℃下離心20min，棄去上清液，將沉淀溶于3.0mL酶溶解液（0.05mol／L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，內(nèi)含20mmol／L的丙酮酸鈉，0.5mmol／L MgCl2）中，用于酶活力測定。

酶活力測定：取0.4mL酶提取液，加入0.1mL 0.05mol／L pH＝7 的磷 酸鉀緩沖 液，再加入0.5mL酶反應(yīng)液（0.05mol／L pH＝7的磷酸鉀緩沖液，內(nèi)含 24mmol／L 的丙酮酸鈉，0.6mmol／L MgCl2，1mmol／L的 TPP，20μmol／L的FAD），搖勻后放入35℃恒溫水域中暗處反應(yīng)1h后，立即加入0.1mL 3mol／L的 H2SO4終止反應(yīng)，并置于60℃恒溫水域中脫羧反應(yīng)15min，然后依次加入0.5mL 0.5%的肌酸和0.5mL 5%甲萘酚（溶于2.5mol／L的NaOH溶液）。60℃顯色反應(yīng)15min，冷卻后于525nm處測定A值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AD－67對玉米的保護(hù)效果

AD－67單獨(dú)作用于玉米植株時(shí)，對玉米根長和株高有輕微的促進(jìn)作用，但各處理間差異不顯著（表1，表2）。在單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時(shí)，AD－67對由單嘧磺隆產(chǎn)生的對玉米根長和株高的抑制均有緩解作用，且在相同的單嘧磺隆濃度時(shí)，不同濃度的安全劑處理間保護(hù)效果差異顯著。AD－67濃度在1mg／kg時(shí)對各濃度單嘧磺隆產(chǎn)生的藥害解毒效果最好，該處理下，上述3個(gè)單嘧磺隆濃度玉米的根長分別為空白對照的107.3%、91.86%、77.71%；株高分別為空白對照的100.82%、100.24%、91.83%。以單嘧磺隆上述各濃度不使用安全劑的處理為對照，該處理下使玉米主根長分別增加了27.81%、28.79%和21.89%；玉米株高分別增加了12.58%、21.69%和18.88%。隨著單嘧磺隆濃度的增加，AD－67保護(hù)玉米的效果降低，這與前期安全劑研究的變化規(guī)律一致［12］。

表1 AD－67對玉米主根長的保護(hù)效果1）

表2 AD－67對玉米株高的保護(hù)效果1）

2.2 AD－67對玉米葉中GSH含量的影響

單獨(dú)用安全劑AD－67浸種，可提高玉米葉片GSH含量（表3）。當(dāng)單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時(shí)，AD－67各濃度均能增加玉米葉中GSH的含量；同一單嘧磺隆濃度下，安全劑各濃度處理間的效果差異達(dá)到極顯著水平（表3）。當(dāng)AD－67濃度為1mg／kg時(shí)，單嘧磺隆3個(gè)處理濃度玉米葉片中GSH含量增加最多，與無AD－67浸種的玉米葉片中GSH含量相比，分別增加了19.46%、23.55%和19.24%。結(jié)果表明：安全劑AD－67對玉米葉片中GSH含量的影響與對主根長和株高的保護(hù)效果相一致，即AD－67能夠提高玉米葉中GSH含量，有利于催化GSH綴合更多的除草劑，從而快速解除除草劑的毒害作用，達(dá)到保護(hù)作物的目的［13］。

表3 AD－67對玉米葉中GSH含量的影響1）

2.3 AD－67對玉米根中ALS酶活性的影響

單獨(dú)使用AD－67浸種時(shí)，能提高玉米根中ALS活性（表4）。單嘧磺隆濃度為0.025、0.035mg／kg和0.050mg／kg時(shí)，AD－67各濃度處理，玉米根中ALS的活性均有一定程度提高；在單嘧磺隆同一濃度時(shí)，安全劑不同處理間的ALS活性差異達(dá)到極顯著水平。其中AD－67濃度為1mg／kg時(shí)，玉米根中ALS活性最高，與無AD－67浸種的玉米根中ALS相比，活 性 分 別 增 加 了 26.66%、40.00% 和33.33%。上述結(jié)果說明：在活體條件下單嘧磺隆對玉米幼苗ALS有抑制作用，而保護(hù)劑AD－67明顯誘導(dǎo)了玉米幼苗中ALS的活性，提高了玉米幼苗中ALS的含量。

表4 AD－67對玉米根中ALS活性的影響1）

3 結(jié)論與討論

GSH是生物細(xì)胞中普遍存在的一種具有特殊功能的多肽，在生物的許多代謝生理過程中起到重要的生理作用。在高等植物的代謝生理過程中發(fā)現(xiàn)，植物在抵御不良環(huán)境及提高抗逆作用中，GSH起著非常重要的作用。研究表明：安全劑可以刺激玉米和其他植物中的GSH水平，達(dá)到解毒的目的［14－15］。單嘧磺隆通過對ALS酶的抑制而阻斷支鏈氨基酸的生物合成，進(jìn)而快速抑制植物細(xì)胞的分裂與伸長，達(dá)到化學(xué)除草的目的。范志金等研究表明，單嘧磺隆對不同玉米品種ALS的活性影響存在差異，高濃度則具有抑制作用，活體ALS活力差異與玉米品種的耐藥力無相關(guān)性［6］。路凱等研究表明NA能間接激活A(yù)LS活性，從而減輕胺苯磺隆對水稻的藥害［16］。安全劑對于ALS抑制劑的解毒作用機(jī)理并不是一個(gè)簡單的線性化作用過程，也不是由一種物質(zhì)或一個(gè)原因引起的。參與這一過程的各種物質(zhì)交織在一起，相互作用和牽制，形成一種復(fù)雜的網(wǎng)式過程，從而出現(xiàn)解毒差異—表征［17］。

本研究表明：單嘧磺隆對玉米幼苗的生長指標(biāo)（根長、株高）和生理指標(biāo)（GSH含量、ALS活性）都有抑制作用；隨著單嘧磺隆濃度的增加，抑制作用加強(qiáng)，且對生理指標(biāo)的抑制比對生長指標(biāo)的程度大，即植株生長指標(biāo)還沒顯示出被害癥狀時(shí)其體內(nèi)某些生理指標(biāo)已經(jīng)發(fā)生顯著變化。在安全劑AD－67浸種處理下，玉米的生長指標(biāo)、GSH含量、ALS活性均有不同程度的提高；在同一單嘧磺隆濃度下，安全劑各濃度處理之間的解毒效果差異達(dá)到顯著或極顯著的水平，當(dāng)AD－67濃度為1mg／kg時(shí)，對玉米的保護(hù)效果最好。試驗(yàn)顯示：當(dāng)AD－67與單嘧磺隆濃度為一定配比時(shí)，才能較好地起到保護(hù)作物免受除草劑藥害的作用。這說明高濃度的安全劑對作物也是一種外源化合物，會刺激和影響作物的生長［18］。AD－67能夠提高玉米體內(nèi)GSH含量，并增加ALS活性，從而緩解了單嘧磺隆對玉米幼苗產(chǎn)生的藥害，表明了這是減輕單嘧磺隆對玉米藥害的重要途徑之一，即AD－67的解毒和代謝過程與作物體內(nèi)的GSH和ALS含量密切相關(guān)。

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