商陸對阿霉素腎病腎小球胞外基質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)研究

李 明，張克非，楊亦彬

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563000）

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）在腎小球內(nèi)過度蓄積，是腎小球硬化的主要病理特征性變化，且其成分過度蓄積可加速硬化進(jìn)程，因此減少基質(zhì)過度蓄積，也是臨床治療腎小球硬化的重點(diǎn)[1]。商陸（pokeberry root）是傳統(tǒng)的瀉下利水藥，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明商陸對腎功能有一定保護(hù)作用[2,3]。本研究旨在觀察商陸水煎劑是否可減輕ECM蓄積，為其防治腎小球硬化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠50只，三月齡，體重200±20g，第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所提供，合格證號（scxk渝20020003）。

1.2 試劑及藥品 小鼠抗MMP-2單克隆抗體（批號：567P608C），小鼠抗FN單克隆抗體（批號：1351P11E），兔抗LN多克隆抗體（批號：082A511C），均購自NEOMARKERS公司；阿霉素（10mg/支，批號0411E1，深圳萬樂藥業(yè)有限公司）；商陸水煎劑：貴州本地產(chǎn)野生商陸飲片，按商陸/醋=10/3的比例制成醋炙品，干燥備用（含30%的醋煮商陸毒性最?。4]，用時(shí)按中藥常規(guī)方法煎煮。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 SD大鼠隨機(jī)分為：①對照組10只；②模型組10只；③模型治療組，包括商陸組、依那普利組各10只。

1.3.2 制模方法 參照文獻(xiàn)[5]：1.5%戊巴比妥納50mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒在無菌條件下背部切口1～1.5cm，暴露左腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結(jié)扎左腎門血管，切除左腎并縫合切口。術(shù)后第1周予阿霉素4mg/kg尾靜脈注射，第4周再次注射3mg/kg。對照組：分離左腎臟脂肪包膜，不切除左腎并縫合切口，術(shù)后第1周尾靜脈注射生理鹽水0.5mL，4wk后等量重復(fù)注射。

1.3.3 治療方法 商陸組、依那普利組分別于成模1wk后給予商陸水煎劑4000mg/kg.d、依那普利混懸液4mg/kg.d灌胃，對照組、模型組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日一次，自由飲食。14wk后將大鼠麻醉處死，取腎臟標(biāo)本石蠟包埋。

1.4 腎組織病理學(xué)檢查方法

1.4.1 ECM相對面積 每張PASM染色切片在40倍物鏡下隨機(jī)取20個(gè)完整且不重復(fù)腎小球，采集腎小球基質(zhì)著色區(qū)，計(jì)算腎小球基質(zhì)面積/腎小球面積比，取均值(Leica分析系統(tǒng))。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SABC法，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。每張切片在40倍物鏡隨機(jī)取20個(gè)完整且不重復(fù)的腎小球,Leica分析系統(tǒng)分析，計(jì)算腎小球陽性目標(biāo)面積/腎小球面積，取均值。

2 結(jié)果

2.1 ECM相對面積 模型組腎小球系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)中度至重度增生并呈彌漫性分布，商陸組和依那普利組腎小球系膜基質(zhì)增生程度較模型組明顯減輕，其腎小球ECM相對面積均低于模型組 (P<0.05)，二者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹥0.05)，見表 1。

2.2 免疫組化結(jié)果 與模型組比較，商陸組、依那普利組FN、LN腎小球陽性著染面積明顯減少（P<0.05），二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；商陸組、依那普利組MMP-2在腎小球陽性著染面積明顯高于模型組(P<0.05)，商陸組低于依那普利組(P<0.05)，見表2和圖1。

圖1 FN、LN、MMP-2免疫組化結(jié)果

表1 各組大鼠腎小球ECM相對面積比較（s）

表1 各組大鼠腎小球ECM相對面積比較（s）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別 n ECM(%)正常對照組 10 4.31±1.85模型組 10 13.33±2.24▲商陸組 10 7.83±2.60▲△依那普利組 10 6.06±2.02△

表2 各組大鼠腎小球LN、FN和MMP-2相對陽性面積（s）

表2 各組大鼠腎小球LN、FN和MMP-2相對陽性面積（s）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與依那普利組比較，◆P<0.05。

組別 n FN（%）LN(%)MMP-2(%)正常對照組 10 4.20±1.33 5.21±1.92 39.13±6.52模型組 10 18.36±4.54▲ 20.58±5.74▲ 15.05±4.56▲商陸組 10 8.35±2.69▲△ 10.76±2.98▲△ 27.31±4.88▲△◆依那普利組 10 8.07±2.61▲△ 9.06±4.01▲△ 36.11±3.77△

3 討論

慢性腎臟病腎小球系膜細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的大量堆積是腎小球進(jìn)展性硬化的兩個(gè)顯著的特征，ECM除促進(jìn)各種炎性細(xì)胞的遷移聚集和增殖，加速硬化進(jìn)程外，還可調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)硬化進(jìn)展[1]。ECM積蓄由ECM的合成和降解兩方面決定，層粘連蛋白（LN）、纖連蛋白（FN）等是ECM的主要成分，而基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）是腎臟主要的基質(zhì)降解酶，在腎臟發(fā)生病變時(shí),細(xì)胞外基質(zhì)的正常組成成分可異常表達(dá)，而基質(zhì)降解系統(tǒng)的降解功能亦減退。

單側(cè)腎臟切除加重復(fù)注射阿霉素造模被認(rèn)為是研究系膜增生性腎炎向腎小球硬化轉(zhuǎn)化進(jìn)程中的一個(gè)組間差異小，穩(wěn)定性和重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[5]。本實(shí)驗(yàn)病理檢查示模型組腎小球ECM相對面積明顯高于對照組（P<0.01），系膜基質(zhì)中度至重度增生并呈彌漫性分布，毛細(xì)血管開放不良，部分腎小球呈局灶節(jié)段硬化，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。

慢性腎臟病時(shí)因細(xì)胞因子、免疫介導(dǎo)、炎癥損傷、氧化應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)紊亂等可直接或間接導(dǎo)致ECM成分改變。本實(shí)驗(yàn)顯示模型組腎小球FN、LN表達(dá)上調(diào)，MMP-2下調(diào)，而商陸水煎劑灌胃處理模型大鼠腎小球ECM相對面積較模型組明顯減少 (P<0.05)，腎小球 FN、LN 表達(dá)降低（P﹤0.05），MMP-2 表達(dá)增強(qiáng)（P﹤0.05），提示商陸水煎劑具有下調(diào)腎小球LN、FN表達(dá)、上調(diào)腎小球MMP-2表達(dá)、減少ECM過度蓄積。商陸是傳統(tǒng)的瀉下利水藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明商陸對免疫系統(tǒng)有重要調(diào)節(jié)作用，其在慢性腎臟病中的治療作用也日益受到重視。研究表明商陸可抑制TNF、NO、IL-1、IL-2等炎癥介質(zhì)釋放，抑制中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，顯著降低ICAM-1和CD18表達(dá)[6,7]，商陸提取物可抑制高糖引起的系膜細(xì)胞增殖，減少TGF-β產(chǎn)生[8]，降低實(shí)驗(yàn)性糖尿病和系膜增生性腎炎大鼠尿蛋白排泄[2,3]，這些研究結(jié)果提示商陸可能通過多種途徑調(diào)控ECM積蓄。

許多研究已證實(shí)ACEI具有較好的減輕ECM蓄積作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示商陸組在降低ECM相對面積和下調(diào)LN、FN的表達(dá)與依那普利組無明顯差異(P﹥0.05)，但上調(diào)腎小球MM-2卻低于依那普利（P﹤0.05）,是商陸降低ECM蓄積不如ACEI類藥物還是實(shí)驗(yàn)技術(shù)原因有待進(jìn)一步研究。

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