當(dāng)歸補(bǔ)血滴丸提取工藝研究

劉麗芳 盧海剛 邊虹錚 曹德英

當(dāng)歸補(bǔ)血湯始載于金元四大家之一李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論·暑傷胃氣論》(公元1247年)，為經(jīng)典的氣血雙補(bǔ)名方，本方組成簡(jiǎn)單，由黃芪一兩，當(dāng)歸二錢，芪歸用量是5∶1，是現(xiàn)代復(fù)方研究的代表方劑。重用黃芪大補(bǔ)脾肺之氣，以資生血之源，與當(dāng)歸合用，養(yǎng)血和營(yíng)，則陽生陰長(zhǎng)，氣血兩旺，兩藥互伍，共同發(fā)揮補(bǔ)氣生血活血作用，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用［1，2］。滴丸劑作為現(xiàn)代中藥劑型，是近年來中藥制劑研究的熱點(diǎn)。中藥材的提取對(duì)于滴丸質(zhì)量起至關(guān)重要作用，為此，本研究擬以水提取當(dāng)歸和黃芪中的有效成分，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究影響提取的因素，優(yōu)化提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Re53-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TG328B電光分析天平(上海天平儀器廠);高效液相色譜儀、色譜工作站(Lablliance公司);當(dāng)歸、黃芪購自蘭州黃河藥材公司;阿魏酸對(duì)照品購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 當(dāng)歸補(bǔ)血滴丸提取工藝研究

1.2.1 煎煮時(shí)間的選擇:取當(dāng)歸10 g，黃芪50 g，加入10倍量水，煎煮1 次，時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2 和2.5 h。濾過，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，所得濃縮液置100 ml棕色量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，比較不同煎煮時(shí)間時(shí)阿魏酸的含量。

1.2.2 煎煮次數(shù)的選擇:取當(dāng)歸10 g，黃芪50 g，加入10倍量水，煎煮時(shí)間1 h，分別煎煮1、2、3、4和5次。濾過，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，所得濃縮液置100 ml的棕色量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，比較不同煎煮次數(shù)時(shí)阿魏酸的含量。

1.2.3 加水量的選擇:取當(dāng)歸 10 g，黃芪 50 g，分別加入 6、8、10、12、15倍量水，煎煮1 h，濾過，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，所得濃縮液置100 ml的棕色量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，比較不同加水量時(shí)阿魏酸的含量。

1.2.4 提取工藝的優(yōu)化:根據(jù)以上單因素考察結(jié)果，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以阿魏酸含量為指標(biāo)，進(jìn)一步考察煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和加水量的影響。

1.3 含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.5% 冰醋酸水溶液(35∶65);流速:1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):322 nm;柱溫:40℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和樣品溶液的預(yù)處理:精密稱取干燥恒重的阿魏酸對(duì)照品約5 mg，加水溶解并定溶至100 ml量瓶中，作為儲(chǔ)備液。用此儲(chǔ)備液分別配制 2.5、5.0、10.0、12.5 和25.0 μg/ml的溶液。按上述色譜條件，各精密吸取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對(duì)照品峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，求回歸方程。采用甲醇沉淀法，取樣品溶液10 ml置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度;精密吸取定容后溶液10 ml，3000 r/min 離心10 min;取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，精密吸取20 μl注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血滴丸提取工藝研究 根據(jù)煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和加水量的單因素考察結(jié)果表明，煎煮時(shí)間超過1.5 h、煎煮次數(shù)超過3次，用水量超過12倍，阿魏酸含量無明顯增加，因此，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，因素水平安排見表1，正交試驗(yàn)安排見表2，方差分析結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果表明:A、C因素的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B因素的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此，確定最佳提取條件為 A3B3C2，即加12 倍量水，提取2 次，1.5 h/次。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 以最優(yōu)處方提取的三批藥材，結(jié)果阿魏酸平均含量為 (33.6±2.6)μg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)基本一致，說明所篩選的提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y=8759.3X+1091.3，r=0.9994。結(jié)果表明在2.69 ～26.9 μg/ml范圍內(nèi)阿魏酸的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，阿魏酸具有抗氧化和清除自由基作用，能有效抑制血小板聚集和血栓形成［3，4］。阿魏酸是中藥當(dāng)歸中的主要有效成分之一，也是當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的主要藥效物質(zhì)，故本研究以阿魏酸的含量為指標(biāo)篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯最佳提取工藝。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，阿魏酸不穩(wěn)定，見光易分解［5］。對(duì)照品溶液、供試品溶液均應(yīng)置棕色瓶中保存，否則易發(fā)生分解而使含量降低，故在標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的配制中使用棕色量瓶，并在水煎液的制備過程中避免光線直射。阿魏酸為弱有機(jī)酸，在標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液中加入一定量的冰醋酸，使得阿魏酸的穩(wěn)定性顯著增加，提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，HPLC測(cè)定中藥制劑中阿魏酸的文獻(xiàn)報(bào)道較多，其中樣品溶液的常規(guī)預(yù)處理方法有兩種，萃取法［6］和甲醇沉淀法［7］。萃取法得到圖譜中雜質(zhì)大部分已經(jīng)被除去，雜質(zhì)峰數(shù)目較少，但阿魏酸柱效相對(duì)較低，色譜峰面積較小。甲醇沉淀法得到的圖譜中阿魏酸柱效較高，色譜峰面積大，雖然雜質(zhì)峰較多，但與阿魏酸分離度較好，不影響分析結(jié)果。并且從操作的角度講，萃取法操作過程繁瑣，樣品需要反復(fù)的洗滌與萃取，因而易造成阿魏酸的損失。甲醇沉淀法只經(jīng)過一步離心操作，過程簡(jiǎn)單，加入甲醇后，藥液濾過更容易。因此，我們最終選用甲醇沉淀法作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯水提液樣品的預(yù)處理方法。

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2 范穎，陳信義.當(dāng)歸補(bǔ)血湯源流及配伍效用關(guān)系研究進(jìn)展.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12:61-65.

3 鄧永健，郭志偉，王萌.當(dāng)歸的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展.新疆中醫(yī)藥，2006，24:109-113.

4 夏泉，張平，李紹平，等.當(dāng)歸的藥理作用研究進(jìn)展.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15:164-166.

5 侯林中，劉曉紅，張熙潔.正交試驗(yàn)優(yōu)選寬心口服液中當(dāng)歸川芎提取工藝.中國(guó)藥學(xué)，2007，42:794-796.

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7 陳璐，陶婷婷，王天志.RP-HPLC測(cè)定藏藥柳茶中阿魏酸和異阿魏酸的含量.華西藥學(xué)雜志，2006，21:196-197.