劉麗芳 盧海剛 邊虹錚 曹德英
當(dāng)歸補(bǔ)血湯始載于金元四大家之一李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論·暑傷胃氣論》(公元1247年),為經(jīng)典的氣血雙補(bǔ)名方,本方組成簡單,由黃芪一兩,當(dāng)歸二錢,芪歸用量是5∶1,是現(xiàn)代復(fù)方研究的代表方劑。重用黃芪大補(bǔ)脾肺之氣,以資生血之源,與當(dāng)歸合用,養(yǎng)血和營,則陽生陰長,氣血兩旺,兩藥互伍,共同發(fā)揮補(bǔ)氣生血活血作用,在臨床上有著廣泛的應(yīng)用[1,2]。滴丸劑作為現(xiàn)代中藥劑型,是近年來中藥制劑研究的熱點(diǎn)。中藥材的提取對于滴丸質(zhì)量起至關(guān)重要作用,為此,本研究擬以水提取當(dāng)歸和黃芪中的有效成分,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究影響提取的因素,優(yōu)化提取工藝。
1.1 儀器與試藥 Re53-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TG328B電光分析天平(上海天平儀器廠);高效液相色譜儀、色譜工作站(Lablliance公司);當(dāng)歸、黃芪購自蘭州黃河藥材公司;阿魏酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所。
1.2 當(dāng)歸補(bǔ)血滴丸提取工藝研究
1.2.1 煎煮時(shí)間的選擇:取當(dāng)歸10 g,黃芪50 g,加入10倍量水,煎煮1 次,時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2 和2.5 h。濾過,濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮,所得濃縮液置100 ml棕色量瓶內(nèi),加蒸餾水定容至刻度,搖勻,比較不同煎煮時(shí)間時(shí)阿魏酸的含量。
1.2.2 煎煮次數(shù)的選擇:取當(dāng)歸10 g,黃芪50 g,加入10倍量水,煎煮時(shí)間1 h,分別煎煮1、2、3、4和5次。濾過,濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮,所得濃縮液置100 ml的棕色量瓶內(nèi),加蒸餾水定容至刻度,搖勻,比較不同煎煮次數(shù)時(shí)阿魏酸的含量。
1.2.3 加水量的選擇:取當(dāng)歸 10 g,黃芪 50 g,分別加入 6、8、10、12、15倍量水,煎煮1 h,濾過,濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮,所得濃縮液置100 ml的棕色量瓶內(nèi),加蒸餾水定容至刻度,搖勻,比較不同加水量時(shí)阿魏酸的含量。
1.2.4 提取工藝的優(yōu)化:根據(jù)以上單因素考察結(jié)果,采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,以阿魏酸含量為指標(biāo),進(jìn)一步考察煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和加水量的影響。
1.3 含量測定
1.3.1 色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(150 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇 -0.5% 冰醋酸水溶液(35∶65);流速:1.0 ml/min;檢測波長:322 nm;柱溫:40℃。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和樣品溶液的預(yù)處理:精密稱取干燥恒重的阿魏酸對照品約5 mg,加水溶解并定溶至100 ml量瓶中,作為儲備液。用此儲備液分別配制 2.5、5.0、10.0、12.5 和25.0 μg/ml的溶液。按上述色譜條件,各精密吸取 20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以對照品峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸,求回歸方程。采用甲醇沉淀法,取樣品溶液10 ml置50 ml棕色容量瓶中,加甲醇定容至刻度;精密吸取定容后溶液10 ml,3000 r/min 離心10 min;取上清液,0.22 μm 微孔濾膜濾過,精密吸取20 μl注入液相色譜儀,測定,即得。
2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血滴丸提取工藝研究 根據(jù)煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和加水量的單因素考察結(jié)果表明,煎煮時(shí)間超過1.5 h、煎煮次數(shù)超過3次,用水量超過12倍,阿魏酸含量無明顯增加,因此,采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,因素水平安排見表1,正交試驗(yàn)安排見表2,方差分析結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果表明:A、C因素的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B因素的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此,確定最佳提取條件為 A3B3C2,即加12 倍量水,提取2 次,1.5 h/次。
2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 以最優(yōu)處方提取的三批藥材,結(jié)果阿魏酸平均含量為 (33.6±2.6)μg/g,驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)基本一致,說明所篩選的提取工藝條件穩(wěn)定可行。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 方差分析
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 以對照品濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:Y=8759.3X+1091.3,r=0.9994。結(jié)果表明在2.69 ~26.9 μg/ml范圍內(nèi)阿魏酸的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,阿魏酸具有抗氧化和清除自由基作用,能有效抑制血小板聚集和血栓形成[3,4]。阿魏酸是中藥當(dāng)歸中的主要有效成分之一,也是當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的主要藥效物質(zhì),故本研究以阿魏酸的含量為指標(biāo)篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯最佳提取工藝。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,阿魏酸不穩(wěn)定,見光易分解[5]。對照品溶液、供試品溶液均應(yīng)置棕色瓶中保存,否則易發(fā)生分解而使含量降低,故在標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的配制中使用棕色量瓶,并在水煎液的制備過程中避免光線直射。阿魏酸為弱有機(jī)酸,在標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液中加入一定量的冰醋酸,使得阿魏酸的穩(wěn)定性顯著增加,提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
目前,HPLC測定中藥制劑中阿魏酸的文獻(xiàn)報(bào)道較多,其中樣品溶液的常規(guī)預(yù)處理方法有兩種,萃取法[6]和甲醇沉淀法[7]。萃取法得到圖譜中雜質(zhì)大部分已經(jīng)被除去,雜質(zhì)峰數(shù)目較少,但阿魏酸柱效相對較低,色譜峰面積較小。甲醇沉淀法得到的圖譜中阿魏酸柱效較高,色譜峰面積大,雖然雜質(zhì)峰較多,但與阿魏酸分離度較好,不影響分析結(jié)果。并且從操作的角度講,萃取法操作過程繁瑣,樣品需要反復(fù)的洗滌與萃取,因而易造成阿魏酸的損失。甲醇沉淀法只經(jīng)過一步離心操作,過程簡單,加入甲醇后,藥液濾過更容易。因此,我們最終選用甲醇沉淀法作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯水提液樣品的預(yù)處理方法。
1 黃兆勝,危建安.當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥理作用研究進(jìn)展.中藥藥理與臨床,2001,17:48-49.
2 范穎,陳信義.當(dāng)歸補(bǔ)血湯源流及配伍效用關(guān)系研究進(jìn)展.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12:61-65.
3 鄧永健,郭志偉,王萌.當(dāng)歸的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展.新疆中醫(yī)藥,2006,24:109-113.
4 夏泉,張平,李紹平,等.當(dāng)歸的藥理作用研究進(jìn)展.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2004,15:164-166.
5 侯林中,劉曉紅,張熙潔.正交試驗(yàn)優(yōu)選寬心口服液中當(dāng)歸川芎提取工藝.中國藥學(xué),2007,42:794-796.
6 胡傳芹,宋金春,曾俊芬,等.高效液相色譜法測定復(fù)方當(dāng)歸注射液中阿魏酸含量.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2005,25:441-443.
7 陳璐,陶婷婷,王天志.RP-HPLC測定藏藥柳茶中阿魏酸和異阿魏酸的含量.華西藥學(xué)雜志,2006,21:196-197.