菊苣種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP研究

羅燕，白史且，彭燕，張玉，馬嘯

（1.四川省草原科學(xué)研究院 四川 成都611731；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系 四川 雅安625014）

菊苣（Cichoriumintybus）為多年生草本植物，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用牧草，原產(chǎn)于地中海、中亞和北非。菊苣在大洋洲的新西蘭、澳大利亞和歐洲法國(guó)、意大利以及北美洲的美國(guó)等地亦為重要的牧草資源［1］?？蓪⒕哲暮图Z食作物進(jìn)行間種，可解決牧草種植與糧食作物爭(zhēng)地問(wèn)題，促進(jìn)種植業(yè)結(jié)構(gòu)向多元化發(fā)展［2］。在我國(guó)，菊苣主要分布于北京（百花山）、黑龍江（饒河）、遼寧（大連）、山西、陜西、新疆（烏魯木齊、伊寧、阿勒泰）等地，生于濱?；牡亍⒑舆叀⑺疁线吇蛏狡?。

目前，我國(guó)已經(jīng)登記了2個(gè)菊苣品種，皆為引進(jìn)品種。從總體而言，菊苣資源的研究相對(duì)于其他牧草和作物也還有一定的差距，一些珍貴的優(yōu)良生態(tài)型以及居群分布正在縮小，菊苣基因資源還在丟失，資源研究的深度和資源收集的廣度不夠，可以供篩選的優(yōu)秀種質(zhì)缺乏，嚴(yán)重影響了菊苣品種的選育。當(dāng)前，圍繞菊苣遺傳多樣性的研究已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，Van Cutsem等［3］采用AFLP標(biāo)記對(duì)菊苣野生種和栽培種之間的基因流動(dòng)進(jìn)行了研究；Baes和 Van Cutsem［4，5］用同工酶，Kiers等［6］及 Koch和Jung［7］用 RAPD和 AFLP標(biāo)記證明菊苣栽培種中存在豐富的遺傳多樣性；Baes和Van Cutsem［5］研究了栽培野生種、商業(yè)品種和布魯塞爾菊苣3個(gè)基因庫(kù)的10種同工酶的多態(tài)性。目前，對(duì)菊苣種質(zhì)資源進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記的研究尚未見報(bào)道。

DNA是生物的遺傳物質(zhì)，DNA的多態(tài)性是生物多樣性的本質(zhì)內(nèi)容。目前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都已經(jīng)利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)在草坪草及牧草上進(jìn)行了各種研究［8－10］。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence－related amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱SRAP）［11］，是由 Li和 Quiros［12］在2001年創(chuàng)建的一種 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)［13］，它克服了 RAPD（random amplified polymorphic DNA）重復(fù)性差、SSR（simple sequence repeats）位點(diǎn)較少、AFLP（amplified fragment length polymorphism）成本高的缺點(diǎn)，其重復(fù)性和穩(wěn)定性好，已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)和遺傳多樣性分析，是當(dāng)前檢測(cè)種質(zhì)資源遺傳多樣性、構(gòu)建高密度連鎖圖譜、定位克隆基因、品種鑒定等的有力工具。SRAP在草業(yè)科學(xué)領(lǐng)域中的研究不多，Budak等［13］利用34對(duì)SRAP引物組合分析了53份野牛草（Buchlo?dactyloides）基因型之間的遺傳多樣性及表型關(guān)系。陳宣等［14］對(duì)結(jié)縷草屬（Zoysia）植物耐鹽性SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行了研究。季楊等［15］對(duì)多花黑麥草品種（系）（Loliummultiflorum）間雜交及其雜種后代進(jìn)行SRAP遺傳分析。薛丹丹等［16］對(duì)通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)結(jié)縷草屬植物種間雜交的5個(gè)組合37份雜交后代進(jìn)行了真假雜種的鑒定。

本研究采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)48份菊苣材料的基因組DNA進(jìn)行了多態(tài)性擴(kuò)增，旨在從分子水平對(duì)不同類群菊苣資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為綜合評(píng)價(jià)菊苣種質(zhì)資源，篩選菊苣優(yōu)良種質(zhì)和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菊苣種質(zhì)材料從國(guó)內(nèi)外收集而來(lái)，總計(jì)48份。其中13份來(lái)自意大利，10份來(lái)自荷蘭，10份來(lái)自法國(guó)，3份來(lái)自匈牙利，2份來(lái)自德國(guó)，2份來(lái)自波蘭，2份來(lái)自瑞士，1份來(lái)自葡萄牙，5份來(lái)自四川省草原科學(xué)研究院（表1）。

表1 供試菊苣的資源編號(hào)及來(lái)源Table 1 Accesion code and sources of C.intybus used in this study

1.2 基因組DNA提取

2008年3月隨機(jī)選取不同材料的菊苣健康幼葉，采用Plant Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行DNA提取。通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，合格的DNA樣品于－20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP－PCR反應(yīng)

參照Li等發(fā)表的引物［9］，設(shè)計(jì)了8條上游引物和11條下游引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表2）。SRAP－PCR反應(yīng)采用的是復(fù)性變溫法：循環(huán)包括94℃變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；之后35個(gè)循環(huán)：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min；4℃保存。

擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μL：模板DNA 4μL（60 ng／μL），10×PCR Buffer 2μL，Mg2＋2μL（25 mmol／L），d NTP 1.6μL（2.5 mmol／L），Tag酶0.4μL（2.5 U／μL），上、下游引物均為0.2μL（10μmol／μL），滅菌水5.2 μL，礦物油覆蓋。

表2 用于菊苣SRAP分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analyses of C.intybus

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和檢測(cè)

DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5×TBE緩沖系統(tǒng)中，用含有溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖電泳分離，同時(shí)以DL 2000 Markers（北京天根生化科技有限公司）作為分子量標(biāo)記。恒壓120 V，時(shí)間150 min，使用BIO－RAD自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物按條帶有無(wú)分別賦值，有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)成遺傳相似矩陣。據(jù)表征矩陣，統(tǒng)計(jì)SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)量，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)率（P）和引物多態(tài)性信息含量（PIC）［17］，PICi＝2fi（1－fi），其中，PICi表示引物“i”的多態(tài)性信息含量，“fi”表示有帶所占的頻率，“1－fi”表示無(wú)帶所占的頻率。利用NTSYS－PC 2.10軟件計(jì)算Dice遺傳相似性系數(shù)（GS），根據(jù)UPGMA法［18］進(jìn)行聚類分系以及采用EIGEN方法進(jìn)行主成分分析（PCo A）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

通過(guò)8條上游引物和11條下游引物的篩選（表3），選定28對(duì)（組）可產(chǎn)生多態(tài)性且重復(fù)性好的引物對(duì)5個(gè)地理類群48個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，共得到333條清晰可辨條帶。其中，多態(tài)性條帶318條，多態(tài)性位點(diǎn) （P）平均為95.09%。平均每對(duì)引物擴(kuò)增出11.89條帶，其中11.36條具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)最多的為17個(gè)，最少的為9個(gè)；多態(tài)信息含量（PIC）范圍為0.23（me3＋em3）到0.44（me1＋em10），平均為0.33；表明供試菊苣材料種質(zhì)間SRAP變異大，多態(tài)性高，存在豐富的遺傳多樣性（表3）。

表3 28對(duì)SRAP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 SRAP results from 28 primer combinations

2.2 供試材料的遺傳多樣性分析

2.2.1 供試菊苣種質(zhì)間親緣關(guān)系分析 對(duì)擴(kuò)增結(jié)果采用Nei－Li相似系數(shù)（GS）計(jì)算方法，得到供試材料遺傳相似性矩陣，以此為依據(jù)分析材料間親緣關(guān)系。48份材料間的GS值范圍為0.55～0.89，平均GS值為0.69。其中PI652004（15號(hào)）和PI652005（16號(hào)），PI651985（17號(hào)）和 PI651986（18號(hào)）遺傳相似系數(shù)最大，為0.89，表明其親緣關(guān)系最近；材料PI651986（18號(hào)）和B－2－7（46號(hào)）的遺傳相似系數(shù)最小，為0.55，表明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從遺傳相似性分析可知，菊苣具有非常豐富的遺傳多樣性（表4）。

2.2.2 供試材料各地理類群的遺傳多樣性指數(shù)地理類群間的遺傳相似系數(shù)分析表明，5個(gè)地理類群的GS值為0.63～0.96，法國(guó)類群和意大利類群的遺傳相似性系數(shù)最大為0.96，它們間的親緣關(guān)系最近。中國(guó)類群和法國(guó)類群的遺傳相似系數(shù)最小為0.63，表明兩類群的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這可能是由于法國(guó)和意大利同屬歐洲，相同或相似的生態(tài)地理環(huán)境加上自然突變、人為選擇及基因漂移的存在使得法國(guó)類群和意大利類群的菊苣在形態(tài)特征、生態(tài)類型和基因等方面保持了一定的趨同性，體現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。而中國(guó)類群和法國(guó)類群的菊苣位于不同的洲，地理隔離可能阻礙了相互間的基因交流，種質(zhì)間的某些獨(dú)特的基因得以保留，使材料間體現(xiàn)出較大的遺傳變異。從多態(tài)性位點(diǎn)率（P）和香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）2個(gè)遺傳多樣性參數(shù)來(lái)看，5個(gè)類群遺傳多樣性水平從高到低的順序?yàn)椋汉商m＞意大利＞歐洲其他地區(qū)＞法國(guó)＞中國(guó)（表5）。

2.3 供試材料基于Nei－Li（Dice）遺傳相似性的聚類分析

基于遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析（圖1）。在遺傳相似系數(shù)為0.68處上把48份菊苣材料聚為5類，來(lái)自相同地區(qū)的材料能基本聚為同一類。

來(lái)自法國(guó)的10份材料聚為Ⅰ類。1號(hào)（PI 651933）和4號(hào)（PI 651936）之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)?號(hào)（PI 651933）來(lái)自法國(guó)曼恩盧瓦爾省（Maine－et－Loire），屬于盧瓦爾河地區(qū)，該地區(qū)氣候溫和；而4號(hào)（PI 651936）來(lái)自法國(guó)埃松省（Essonne），該省是法國(guó)最干燥的省份之一，降水量較低。這種不同的地理位置和多樣的氣候變化，導(dǎo)致材料之間產(chǎn)生多樣性。

表4 供試材料間遺傳相似性系數(shù)Table 4 The genetic similarity index of accessions tested

續(xù)表4 Continued

來(lái)自意大利的13份材料聚為Ⅱ類。意大利屬于地中海沿岸國(guó)家，此地區(qū)屬于典型的地中海型氣候類型，夏季炎熱干燥，冬季溫和多雨，且該區(qū)多為山脈和高原，海岸線曲折，而這樣的氣候以及地理位置容易產(chǎn)生多樣的小生境。

來(lái)自荷蘭的10份材料聚為Ⅲ類。其中，15號(hào)（PI 652004）和16號(hào)（PI 652005），17號(hào)（PI 651985）和18號(hào)（PI 651986）之間的遺傳距離最近，可能是因?yàn)?5號(hào)（PI 652004）和16號(hào)（PI 652005）來(lái)自同一個(gè)地方（South Holland），而 17 號(hào)（PI 651985）和 18 號(hào)（PI 651986）也來(lái)自同一個(gè)地區(qū)（Limburg），類似的生境和氣候?qū)е铝瞬牧现g的一致性，由此可以看出，來(lái)自相同或者相似地理和氣候類型的材料能聚在一起，這為積累提供了合理性。來(lái)自歐洲其他地區(qū)的材料聚為Ⅳ類。

來(lái)自中國(guó)的材料聚為Ⅴ類。其中，45號(hào) （B－1－1）和46號(hào) （B－2－7）能最先聚在一起，這2份材料田間表現(xiàn)為葉片呈墨綠色，葉緣無(wú)鋸齒，且為根部分蘗。

從聚類結(jié)果可以看出，相同或相似地理來(lái)源和氣候類型的材料能基本聚在一起，說(shuō)明遺傳多樣性與地理來(lái)源和氣候類型有一定的關(guān)系。

表5 菊苣不同地理類群遺傳多樣性指數(shù)Table 5 Different geographic group heredity multiple indices of C.intybus

圖1 菊苣的Nei－Li遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li genetic distance

2.4 菊苣主成分分析

對(duì)48份供試菊苣材料的SRAP標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分所能解釋的遺傳變異分別為17.27%，7.64%，5.47%，對(duì)48份菊苣種質(zhì)做前3個(gè)主成分的三維排序圖（圖2），位置靠近者表示關(guān)系密切，遠(yuǎn)離者表示關(guān)系疏遠(yuǎn)，將位置靠近的菊苣材料劃歸為一類，可將供試材料分成五大類，結(jié)果表明主成分分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致，同一地區(qū)的大部分材料基本能聚在一起，主成分分析結(jié)果更直觀地表明了不同菊苣材料的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 SRAP標(biāo)記對(duì)菊苣遺傳多樣性研究的有效性

本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)分析了48份菊苣種質(zhì)的遺傳多樣性關(guān)系。28對(duì)引物在48份菊苣基因組DNA中檢測(cè)到333個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶比例為95.09%，材料間遺傳相似系數(shù)范圍為0.55～0.89，從而在分子水平上證明了不同菊苣之間差異較大，遺傳多樣性豐富。本實(shí)驗(yàn)中，菊苣SRAP標(biāo)記表現(xiàn)出較高的多態(tài)性（95.09%），由此可見，SRAP技術(shù)可以作為研究菊苣遺傳多樣性簡(jiǎn)單、有效的方法。

3.2 菊苣種質(zhì)遺傳變異與地理來(lái)源的相關(guān)性分析

遺傳變異和地理環(huán)境之間的關(guān)系一直是植物種群遺傳學(xué)研究中普遍關(guān)注的問(wèn)題，多數(shù)研究認(rèn)為種質(zhì)的地理分布與分子標(biāo)記間存在相關(guān)性［19］。在本次研究中這種相關(guān)性也得到了證明，研究利用28對(duì)引物對(duì)48份菊苣種質(zhì)資源進(jìn)行了SRAP統(tǒng)計(jì)分析和聚類分析，發(fā)現(xiàn)菊苣材料之間存在著比較高的遺傳分化。

圖2 基于SRAP譜型的菊苣材料主成分分析Fig.2 Principal component analysis based on SRAP patterns in C.intybus

聚類分析及主成分分析表明，供試菊苣材料呈現(xiàn)出較好的地域分布規(guī)律，這可能是由于菊苣材料在進(jìn)化過(guò)程中受到自然選擇淘汰，自然選擇的結(jié)果使得個(gè)體中所發(fā)生的不定向變異造成群體遺傳結(jié)構(gòu)的定向變異，這樣經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化演變，同一地區(qū)大部分材料的基因型可能趨于相似，比如來(lái)自法國(guó)和意大利的材料可以單獨(dú)聚為一類。但是聚類也并非完全符合地域性的分布規(guī)律，比如來(lái)自葡萄牙（PI 652050，30號(hào)）和匈牙利（PI 652020）的材料能聚在一起，而來(lái)自波蘭的2份材料（PI 652007，23號(hào)和PI 652051，24號(hào)）沒(méi)能聚在一起，造成上述這種聚類劃分的現(xiàn)象可能有以下3個(gè)方面的原因：1）基因突變，物種在進(jìn)化過(guò)程中，有個(gè)別的基因發(fā)生了變異，若該突變體能較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，這個(gè)變異基因就能得到保存；2）本研究材料來(lái)源于海拔、氣候特征和土壤類型等方面存在較大差異的地區(qū)，多樣的生境可能阻礙了種質(zhì)間的基因漂移從而造成較大的遺傳差異，但在大的地理?xiàng)l件下如果存在相同或相似的生境條件，相同或相似的選擇壓力和生存環(huán)境導(dǎo)致遠(yuǎn)距離間也可能會(huì)產(chǎn)生遺傳變異；3）是自然因素和人類活動(dòng)造成的，風(fēng)力輸送、江河沖刷、鳥類和人類交通工具的攜帶等都可能使其轉(zhuǎn)入異地?cái)U(kuò)展繁殖。

［1］焦春海.美國(guó)轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)動(dòng)態(tài)［J］.世界農(nóng)業(yè)，2005，11：49－51.

［2］王孝華，阮培均，梅艷，等.玉米與菊苣不同密度間作實(shí)驗(yàn)［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（8）：137－140.

［3］Van Cutsem P，du Jardin P，Boutte C.，etal.Distinction between cultivated and wild chicory gene pools using AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：713－718.

［4］Baes P G，Van Cutsem P J.Chicory seed－lot variety identification by leucine－aminopeptidase and esterase zymogram analysis［J］.Electr－ophoresis，1992，13：885－886.

［5］Baes P G，Van Cutsem P J.Isozyme polymorphism in three gene pools of cultivated chicory （CichoriumintybusL.）［J］.Euphytica，1993，71：143－150.

［6］Kiers A M，Mes T，van der Meijden R，etal.A search for diagnostic AFLP markers inCichoriumspecies with emphasis on endive and chicory cultivar groups［J］.Genome，2000，43：470－476.

［7］Koch G，Jung C.Phylogenic relationship of industrial chicory varieties revealed by RAPDs and AFLPs［J］.Agronomy，1997，17：323－333

［8］王曉麗，凡星，張春，等.用nrDAN ITS序列探討小麥族含St H基因組物種的系統(tǒng)發(fā)育［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（6）：82－90.

［9］范彥，李芳，張新全，等.扁穗牛鞭草種質(zhì)遺傳多樣性的ISSR分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（4）：76－81.

［10］劉偉，張新全，李芳，等.西南地區(qū)野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR標(biāo)記與地理來(lái)源分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（3）：55－61.

［11］Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of some accessions ofCucurbitamaximafrom Spain using RAPD and SBAP markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50：227－238.

［12］Li G，Quiros C F.Sequence－related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455－461.

［13］Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，etal.Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence－related amplified polymorphism markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108：328－334.

［14］陳宣，郭海林，薛丹丹，等.結(jié)縷草屬植物耐鹽性SRAP分子標(biāo)記研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（2）：66－75.

［15］季楊，張新全，馬嘯，等.多花黑麥草品種（系）間雜交及其雜種后代SRAP遺傳分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：260－265.

［16］薛丹丹，郭海林，鄭軼琦，等.結(jié)縷草屬植物雜交后代雜種真實(shí)性鑒定－SRAP分子標(biāo)記［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：72－79.

［17］Roldan－Ruiz I，Dendauw J，Van Bockstaele E，etal.AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses（Loliumspp.）［J］.Molecular Breeding，2000，6：125－134.

［18］Rohlf F J.NTSYS－pc：Numerial Taxonomy and Multivariate Analysis System（Version 2.0）［M］.New York：Exter Software，1994.

［19］Wilson B L，Kitzmiller J，Rolle W，etal.Isozyme variation and its environmental correlates inElymusglaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139－153.