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    堿茅耐鹽堿基因克隆研究進(jìn)展

    2010-06-08 07:52:34任偉王志峰徐安凱
    草業(yè)學(xué)報(bào) 2010年5期
    關(guān)鍵詞:植物研究

    任偉,王志峰,徐安凱

    (吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院,吉林 公主嶺136100)

    堿茅(Puccinellia)是生長在草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍的冷季型多年生禾本科牧草。它的幼苗,在p H值大于10、表土含鹽量5%以上的土壤中,仍能正常生長,被譽(yù)為鹽堿地的先鋒植物[1]。作為一種抗鹽堿、耐低溫、飼用價(jià)值好的優(yōu)良牧草,引起了諸多學(xué)者的重視。以往的科技工作者對(duì)堿茅在鹽堿脅迫下的生理生化反應(yīng)[2-6]、種子萌發(fā)[7-9]、形態(tài)解剖[10-12]、耐鹽機(jī)制[13-17]、遺傳育種及鹽堿地生態(tài)恢復(fù)與改良[18-20]等方面做了詳細(xì)的研究。近年來,隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,許多新的技術(shù)如分子克隆、分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、差異顯示(DDRT)、擬制性消減雜交(SSH)、c DNA微陣列技術(shù)(c DNA microarray)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等廣泛應(yīng)用于堿茅耐鹽機(jī)理的研究,取得許多重要的研究成果。獲得了大量的鹽堿誘導(dǎo)基因,主要集中在鹽堿脅迫條件下,與其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、抗氧化保護(hù)酶、離子通道蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白作用有關(guān)的基因。對(duì)堿茅耐鹽堿基因的挖掘,不僅有助于更好的研究堿茅自身的耐鹽堿機(jī)制,而且可以加快牧草及其他農(nóng)作物的品質(zhì)改良,具有重要的理論意義和很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成基因

    當(dāng)植物遭遇干旱、鹽堿、低溫等逆境時(shí),就會(huì)在體內(nèi)積累各種小分子物質(zhì),提高細(xì)胞液濃度,降低其滲透勢,并保持一定的壓力勢,來維持細(xì)胞的正常膨壓。參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)有很多,大致可分為兩大類。一類是由外界進(jìn)入細(xì)胞的無機(jī)離子,一類是在細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì),如脯氨酸(proline)、甜菜堿(betaine)、芒柄醇(D-ononitol)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)和海藻糖(trehalose)等。

    目前,從植物中克隆的參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的基因主要是BADH基因(甜菜堿醛脫氫酶基因,betaine aldehyde dehydragenase)、P5CS基因(Δ’-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因,Δ’-pyrroline-5-carboxylate synthase)[21]和Imtl基因(肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因,inositol O-methyltrans ferase)[22]。其中BADH基因是目前耐鹽、耐旱基因工程中研究得較深入的基因之一,是公認(rèn)的截至目前為止,最具抗鹽堿效果的基因。楊錚等[23]和鐘鳴等[24]通過同源序列克隆結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE),在朝鮮堿茅中擴(kuò)增出BADH基因,共1 502 bp。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),朝鮮堿茅與大麥(Hordeumbrevisubulatum)、羊草(Leymuschinensis)的同源性高達(dá)89%,含有醛脫氫酶特有的十肽保守序列(VSLELGGKSP),但是與多數(shù)植物中BADH的十肽保守序列(VTLELGGKSP)存在細(xì)微的差別,朝鮮堿茅第2位的T被S取代。其后29位點(diǎn)上含有與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基,可能包含NAD+結(jié)合位點(diǎn)及酶催化位點(diǎn),這些微小的變化及內(nèi)含的結(jié)合位點(diǎn)可能與增強(qiáng)堿茅的耐鹽能力有關(guān)。C末端的SKL信號(hào)肽序列,說明甜菜堿醛脫氫酶定位于朝鮮堿茅體內(nèi)的過氧化物酶體中,而甜菜堿的合成是在葉綠體中完成,朝鮮堿茅是如何完成這個(gè)運(yùn)輸過程的,會(huì)不會(huì)影響它的耐鹽能力,以及這個(gè)BADH基因的耐鹽生理特性如何,都值得做進(jìn)一步的研究。

    2 抗氧化脅迫基因

    鹽脅迫下,細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氧自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH-)等活性氧物質(zhì)(ROS),引起膜脂過氧化,蛋白質(zhì)變性,核酸降解,進(jìn)而導(dǎo)致氧化脅迫的產(chǎn)生。植物有2種防止活性氧危害的系統(tǒng):酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。非酶促系統(tǒng)主要包括一些直接參與活性氧清除的抗氧化物,如抗壞血酸、谷胱甘肽、多元醇、α-生育酚、類胡蘿卜素和黃酮等。酶促系統(tǒng)是指參與保護(hù)反應(yīng)的酶類,主要有超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD),過氧化氫酶(catalase,CAT),抗壞血酸過氧化物酶(aseorbate peroxidase,APX),谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPX),谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase,GST),單脫氧抗壞血酸還原酶(monodehydro aseorbate reduetase,MDHAR)及脫氧抗壞血酸還原酶(dehydroascorbic acid reductase,DHAR)等[25]。在堿茅中,目前研究比較多的是酶促系統(tǒng)中的一些關(guān)鍵酶類。

    2.1 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)基因和鐵蛋白(Fer)基因

    張曉磊[26]根據(jù)已有的堿茅EST片段設(shè)計(jì)基因特異性引物,克隆到了脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和鐵蛋白(ferritin,F(xiàn)er)2個(gè)抗氧化基因,并研究了不同鹽堿處理?xiàng)l件下這2個(gè)基因的表達(dá)變化情況。PtDHAR基因,開放閱讀框(ORF)639 bp,編碼213個(gè)氨基酸,以谷胱甘肽為底物,催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸,在保護(hù)細(xì)胞組分抵御氧化損傷及循環(huán)利用抗壞血酸中起重要作用[27]。鐵蛋白(PtFer)基因開放閱讀框?yàn)?36 bp,編碼111個(gè)氨基酸。在高氧環(huán)境下,氧與鐵反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生氧自由基,對(duì)植物產(chǎn)生巨大的毒性而損害生物有機(jī)體[28]。而鐵蛋白具有很強(qiáng)的貯鐵功能,可以將鐵以無毒的形式貯存起來,為依賴于鐵的生理生化過程起著暫時(shí)性緩沖作用,減少植物體內(nèi)各種氧化脅迫產(chǎn)生的傷害作用,增強(qiáng)植株對(duì)逆境脅迫的抗性,提高植物的生長速度[29]。Northem雜交的結(jié)果表明,鹽堿脅迫后,這2個(gè)基因都有不同程度的表達(dá),但是隨著處理時(shí)間的延長,DHAR的表達(dá)量先增加后減少,而鐵蛋白的表達(dá)量持續(xù)增加。隨著處理濃度的遞增,DHAR的表達(dá)量變化不大,而鐵蛋白的表達(dá)量在200 mmol/L處理后達(dá)到最大,并且堿茅地上部與根部對(duì)脅迫響應(yīng)也存在時(shí)空上的差異[26]。說明同一植物不同基因以及同一基因在堿茅不同部位對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制是不同的,它們之間可能相輔相成,也可能相互制約。今后,應(yīng)該注重不同耐鹽堿基因之間互作效應(yīng)的研究。

    2.2 抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因

    作為抗氧化系統(tǒng)中清除鹽堿脅迫產(chǎn)生的H2O2的主要酶類——抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)[30],它催化H2O2還原為H2O的反應(yīng),對(duì)抗壞血酸具有很高的特異親和性[31]。它的基因在堿茅中也得到分離克?。?2]。序列分析表明,開放讀碼框(ORF)為876 bp,編碼291個(gè)氨基酸。它是細(xì)胞質(zhì)過氧化物體的分泌蛋白,在細(xì)胞質(zhì)中合成,最后通過蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)定位于過氧化物體。過量表達(dá)PutAPX基因的酵母在含H2O2的SD培養(yǎng)基上生長良好,對(duì)組織和細(xì)胞起到了保護(hù)作用,體現(xiàn)了抗壞血酸過氧化物酶在氧化脅迫下的作用。為進(jìn)一步研究APX在堿茅體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及逆境誘導(dǎo)下氧化脅迫的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

    2.3 超氧化物歧化酶(SOD)基因

    超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)是一種含金屬的抗氧化酶。對(duì)于清除氧自由基,防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用[33],與植物的抗旱、抗鹽堿、耐高溫等多種逆境有密切關(guān)系[34],主要可分為3類:Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD[35]。吳建慧等[36]從堿茅根c DNA文庫中分離得到Put-Cu/Zn-SOD基因,全長cDNA,開放讀碼框長615 bp,所編碼的蛋白由204個(gè)氨基酸組成。對(duì)轉(zhuǎn)Put-Cu/Zn-SOD酵母進(jìn)行鹽堿、氧化脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,堿茅Put-Cu/Zn-SOD基因?qū)a2CO3、Na HCO3和H2O2有著良好的抗性,顯著提高了酵母的抗鹽堿和耐氧化能力。也有一些研究表明,單個(gè)抗氧化脅迫基因的能力往往是有限的,所以要從堿茅中克隆更多的抗氧化脅迫基因,研究多個(gè)基因在增強(qiáng)植物抗逆能力中的作用機(jī)理及應(yīng)用。

    3 離子脅迫相關(guān)基因

    植物消除離子脅迫主要有3種機(jī)制,即降低離子吸收、離子外排和離子區(qū)隔化[37,38],這3種機(jī)制的關(guān)鍵在于一些離子通道蛋白和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)離子的選擇性吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)作用。目前,在堿茅中克隆到的編碼此類蛋白的功能基因主要與 HKT(high-affinity K+transporter)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、NHX(Na+/H+exchanger)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、CAX(Ca2+/H+exchanger)反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和質(zhì)子泵蛋白的作用有關(guān)。

    3.1 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NHX)

    植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+exchanger,NHX)分為質(zhì)膜型和液泡膜型2類,依靠H+-ATPase和H+-PPase產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力介導(dǎo)Na+/H+跨膜運(yùn)輸,分別負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排和Na+區(qū)隔化,可以調(diào)節(jié)植物的耐鹽能力[39]。程玉祥[40]分離了堿茅質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PtSOS1),Southern分析表明PtSOS1是單拷貝基因。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,PtSOS1受鹽脅迫上調(diào)表達(dá)。說明PtSOS1可能在星星草(Puccinelliatenuiflora)的抗鹽堿能力中起作用。也有研究表明PtSOS1在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的過表達(dá),提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[41]。但是堿茅質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否參與了體內(nèi)K+的運(yùn)輸,與水稻(Oryzasativa)、擬南芥等植物的運(yùn)轉(zhuǎn)功能是否相同,還不清楚??梢圆捎眠^表達(dá)PtSOS1和反義RNA擬制表達(dá)的方法來研究它的結(jié)構(gòu)與功能。

    3.2 Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(CAX)

    Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Ca2+/H+exchanger,CAX)與Ca2+-ATP酶同是Ca2+外向轉(zhuǎn)運(yùn)器,負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中的Ca2+運(yùn)出細(xì)胞,或運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的液泡及其他細(xì)胞器[42]。CAX是 Ca2+/cation反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Ca2+/cation antiporter,CaCA)的家族之一,在植物、真菌、細(xì)菌和低等脊椎動(dòng)物中均有存在。它是不直接需求三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)器,利用質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力(pmf)來驅(qū)動(dòng)鈣離子的運(yùn)輸[43],對(duì)植物體內(nèi)的離子平衡有著極其重要的作用。Liu等[44]在堿茅中分離到的PutCAX基因,具有提高酵母對(duì)Ca2+或Ba2+抗性的功能,并且首次提出CAX基因具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)Ba2+的功能。通過GFP熒光蛋白標(biāo)記和FM4-64(分子探針)染色,初步證明PutCAX定位于釀酒酵母的液泡膜上。通過觀察PutCAX基因N、C端缺失酵母轉(zhuǎn)化體的生長情況,發(fā)現(xiàn)N端和C端對(duì)PutCAX運(yùn)輸Ca2+或Ba2+具有一定的調(diào)控作用。但是,在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),一些轉(zhuǎn)PutCAX擬南芥植株的生長反而受到擬制,是不是由于PutCAX的過表達(dá),打破了擬南芥體內(nèi)原有的離子平衡穩(wěn)態(tài),還是與其他重金屬離子產(chǎn)生了離子拮抗作用,值得做進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

    3.3 Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(HKT)

    植物HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(high-affinity K+transporter)的主要功能是參與Na+/K+在植物體內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn),已有的研究結(jié)果表明K+/Na+在細(xì)胞內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn),是堿茅體內(nèi)一個(gè)非常重要的耐鹽機(jī)制[17],說明堿茅HKT基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因工程中可能具有重大應(yīng)用價(jià)值。植物HKT蛋白的一些跨膜區(qū)和螺旋區(qū)的氨基酸組成是非常保守的[45],這為利用同源克隆方法分離植物的HKT基因提供了方便。但是HKT基因在總體上的保守性比較差,即使單個(gè)氨基酸殘基的變化也會(huì)顯著改變選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的活性[46]。因此Ardie等[47]將從堿茅中分離的PutHKT2與水稻中克隆的OsHKT2同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥,來研究2個(gè)HKT基因的表達(dá)差異性。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)堿茅PutHKT2基因的酵母表現(xiàn)出高親和性的K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)PutHKT2擬南芥可以抵抗外界Na+、K+和Li+多種離子的脅迫,而轉(zhuǎn)OsHKT2擬南芥僅僅對(duì)外界Na+表現(xiàn)敏感。這也許是堿茅比水稻更耐鹽堿的原因之一。此外,同一蛋白家族的基因,表達(dá)效果也不盡相同。Zhang等[48]對(duì)堿茅質(zhì)膜家族蛋白3(plasma membrane protein 3)的2個(gè)基因PutPMP3-1、PutPMP3-2的研究發(fā)現(xiàn),后者的抗逆能力更強(qiáng)。

    4 參與脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因

    干旱、鹽堿、低溫等外界逆境因子實(shí)質(zhì)上是一種體外信號(hào),當(dāng)植物感知體外信號(hào)后,可以引發(fā)一系列的體內(nèi)信號(hào),進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的改變。在長期進(jìn)化過程中,植物擁有完整的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)用以調(diào)節(jié)各種環(huán)境脅迫引起的響應(yīng)。隨著研究的逐步深入,脫落酸(ABA)被普遍認(rèn)為參與了在鹽脅迫下的滲透脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相應(yīng)地,調(diào)控ABA信號(hào)響應(yīng)基因的表達(dá)也被證實(shí)有助于提高植物的耐鹽性[49]。ABA可以引起氣孔的關(guān)閉,維持植物體內(nèi)水分平衡,保護(hù)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能,提高植物的抗鹽能力[50]。于雪飛和楊傳平[51]在堿茅中分離到受ABA和高鹽誘導(dǎo)的Put-R40g3基因,全長588 bp,編碼195個(gè)氨基酸,與水稻,小麥和擬南芥的氨基酸序列有較高的同源性,綠色熒光蛋白(GFP)定位研究結(jié)果顯示Put-R40g3蛋白存在于酵母細(xì)胞質(zhì)中。顯著提高了酵母對(duì)鹽、干旱及氧化等逆境條件的適應(yīng)能力。

    除了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之外,植物還有很多響應(yīng)鹽脅迫的信號(hào)途徑。已經(jīng)證實(shí)鹽過敏感(salt overly sensitive,SOS)信號(hào)途徑在植物耐鹽中起調(diào)控作用,在這條途徑中,鈣離子作為第2信使與鈣離子結(jié)合蛋白結(jié)合并激活下游一系列蛋白,進(jìn)而調(diào)控植物的耐鹽性[52,53]。此外,蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化也是調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)各種外源信號(hào)的重要機(jī)制,MAP激酶(促分裂原活化蛋白激酶)級(jí)聯(lián)途徑在內(nèi)源、外源信號(hào)傳導(dǎo)過程中均發(fā)揮著重要的作用。MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑包括3種蛋白激酶:MAPKK激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)和 MAP激酶(MAPK),構(gòu)成三級(jí)激酶模式[54-56]。

    大量的證據(jù)表明,這些脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間存在聯(lián)系和交叉作用。鹽脅迫的早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件以及早期誘導(dǎo)表達(dá)的基因是一個(gè)關(guān)鍵所在,分離堿茅體內(nèi)此類脅迫響應(yīng)基因是今后植物耐鹽性研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。在鹽堿脅迫下,堿茅體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞受體是什么?從堿茅感知脅迫信號(hào)到合成相關(guān)基因的表達(dá)蛋白,具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是什么?這些問題的解決將有助于加深對(duì)堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究。

    5 基因組學(xué)在堿茅耐鹽堿機(jī)理研究中的應(yīng)用

    隨著植物基因組學(xué)與生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,為堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究及相關(guān)基因的克隆提供了許多新的技術(shù),如:差異顯示(DDRT)、擬制性消減雜交(SSH)、c DNA微陣列技術(shù)(c DNA microarray)和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等。已有許多學(xué)者應(yīng)用其中一種,或是幾種技術(shù)相結(jié)合的方法,對(duì)不同濃度、不同時(shí)間鹽堿脅迫處理下,堿茅相關(guān)基因的表達(dá)情況,作了詳細(xì)的研究[57-60]。其中已知的同源EST序列,大多數(shù)是與活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)、基因調(diào)控、離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)的基因片段。DNA芯片(DNA chip)的研究結(jié)果顯示,一些基因在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào),另一些基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào),這些基因的功能主要涉及了信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞防御、細(xì)胞代謝等方面,這些差異表達(dá)的基因可能在星星草抗鹽堿過程中具有關(guān)鍵作用。植物的抗鹽堿過程是一個(gè)復(fù)雜的多因子作用體系[61],通過新興的基因組學(xué)研究手段,可以有效獲取鹽堿脅迫下堿茅基因表達(dá)的大量特征信息,從而為系統(tǒng)闡明堿茅抗鹽堿分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),也為尋找未知的抗逆基因提供了新途徑。

    表1 NCBI基因庫中已登錄的堿茅鹽堿誘導(dǎo)基因或片段Table 1 The salt and alkali inducible gene or cDNA segment registered in Gene bank

    6 問題與展望

    目前,在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫中登錄的與堿茅鹽堿誘導(dǎo)相關(guān)的基因或片段總共有17種(表1)。不得不承認(rèn)我國牧草分子生物學(xué)的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于水稻、小麥等農(nóng)作物的研究[62-64]。但是,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的首要逆境脅迫就是土壤鹽漬化,而培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物有望解決這一世界難題。分子選育抗鹽堿植物新品種的關(guān)鍵,就是從鹽生植物里分離抗鹽堿功能基因,堿茅,作為一種寶貴的鹽生種質(zhì)資源、為相關(guān)研究提供了豐富的耐鹽堿基因。加大對(duì)堿茅分子生物學(xué)的研究,不僅有助于培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、牧草和花卉,而且可以為我國鹽堿草地的改良和治理提供理論基礎(chǔ),具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)。

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