堿茅耐鹽堿基因克隆研究進(jìn)展

任偉，王志峰，徐安凱

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺136100）

堿茅（Puccinellia）是生長在草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍的冷季型多年生禾本科牧草。它的幼苗，在p H值大于10、表土含鹽量5%以上的土壤中，仍能正常生長，被譽(yù)為鹽堿地的先鋒植物［1］。作為一種抗鹽堿、耐低溫、飼用價(jià)值好的優(yōu)良牧草，引起了諸多學(xué)者的重視。以往的科技工作者對堿茅在鹽堿脅迫下的生理生化反應(yīng)［2－6］、種子萌發(fā)［7－9］、形態(tài)解剖［10－12］、耐鹽機(jī)制［13－17］、遺傳育種及鹽堿地生態(tài)恢復(fù)與改良［18－20］等方面做了詳細(xì)的研究。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，許多新的技術(shù)如分子克隆、分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、差異顯示（DDRT）、擬制性消減雜交（SSH）、c DNA微陣列技術(shù)（c DNA microarray）、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等廣泛應(yīng)用于堿茅耐鹽機(jī)理的研究，取得許多重要的研究成果。獲得了大量的鹽堿誘導(dǎo)基因，主要集中在鹽堿脅迫條件下，與其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、抗氧化保護(hù)酶、離子通道蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白作用有關(guān)的基因。對堿茅耐鹽堿基因的挖掘，不僅有助于更好的研究堿茅自身的耐鹽堿機(jī)制，而且可以加快牧草及其他農(nóng)作物的品質(zhì)改良，具有重要的理論意義和很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成基因

當(dāng)植物遭遇干旱、鹽堿、低溫等逆境時(shí)，就會(huì)在體內(nèi)積累各種小分子物質(zhì)，提高細(xì)胞液濃度，降低其滲透勢，并保持一定的壓力勢，來維持細(xì)胞的正常膨壓。參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)有很多，大致可分為兩大類。一類是由外界進(jìn)入細(xì)胞的無機(jī)離子，一類是在細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì)，如脯氨酸（proline）、甜菜堿（betaine）、芒柄醇（D－ononitol）、甘露醇（mannitol）、山梨醇（sorbitol）和海藻糖（trehalose）等。

目前，從植物中克隆的參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的基因主要是BADH基因（甜菜堿醛脫氫酶基因，betaine aldehyde dehydragenase）、P5CS基因（Δ’－吡咯啉－5－羧酸合成酶基因，Δ’－pyrroline－5－carboxylate synthase）［21］和Imtl基因（肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因，inositol O－methyltrans ferase）［22］。其中BADH基因是目前耐鹽、耐旱基因工程中研究得較深入的基因之一，是公認(rèn)的截至目前為止，最具抗鹽堿效果的基因。楊錚等［23］和鐘鳴等［24］通過同源序列克隆結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE），在朝鮮堿茅中擴(kuò)增出BADH基因，共1 502 bp。序列比對后發(fā)現(xiàn)，朝鮮堿茅與大麥（Hordeumbrevisubulatum）、羊草（Leymuschinensis）的同源性高達(dá)89%，含有醛脫氫酶特有的十肽保守序列（VSLELGGKSP），但是與多數(shù)植物中BADH的十肽保守序列（VTLELGGKSP）存在細(xì)微的差別，朝鮮堿茅第2位的T被S取代。其后29位點(diǎn)上含有與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基，可能包含NAD＋結(jié)合位點(diǎn)及酶催化位點(diǎn)，這些微小的變化及內(nèi)含的結(jié)合位點(diǎn)可能與增強(qiáng)堿茅的耐鹽能力有關(guān)。C末端的SKL信號肽序列，說明甜菜堿醛脫氫酶定位于朝鮮堿茅體內(nèi)的過氧化物酶體中，而甜菜堿的合成是在葉綠體中完成，朝鮮堿茅是如何完成這個(gè)運(yùn)輸過程的，會(huì)不會(huì)影響它的耐鹽能力，以及這個(gè)BADH基因的耐鹽生理特性如何，都值得做進(jìn)一步的研究。

2 抗氧化脅迫基因

鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氧自由基（O2－）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（OH－）等活性氧物質(zhì)（ROS），引起膜脂過氧化，蛋白質(zhì)變性，核酸降解，進(jìn)而導(dǎo)致氧化脅迫的產(chǎn)生。植物有2種防止活性氧危害的系統(tǒng)：酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。非酶促系統(tǒng)主要包括一些直接參與活性氧清除的抗氧化物，如抗壞血酸、谷胱甘肽、多元醇、α－生育酚、類胡蘿卜素和黃酮等。酶促系統(tǒng)是指參與保護(hù)反應(yīng)的酶類，主要有超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT），抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX），谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPX），谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione s－transferase，GST），單脫氧抗壞血酸還原酶（monodehydro aseorbate reduetase，MDHAR）及脫氧抗壞血酸還原酶（dehydroascorbic acid reductase，DHAR）等［25］。在堿茅中，目前研究比較多的是酶促系統(tǒng)中的一些關(guān)鍵酶類。

2.1 脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）基因和鐵蛋白（Fer）基因

張曉磊［26］根據(jù)已有的堿茅EST片段設(shè)計(jì)基因特異性引物，克隆到了脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)er）2個(gè)抗氧化基因，并研究了不同鹽堿處理?xiàng)l件下這2個(gè)基因的表達(dá)變化情況。PtDHAR基因，開放閱讀框（ORF）639 bp，編碼213個(gè)氨基酸，以谷胱甘肽為底物，催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸，在保護(hù)細(xì)胞組分抵御氧化損傷及循環(huán)利用抗壞血酸中起重要作用［27］。鐵蛋白（PtFer）基因開放閱讀框?yàn)?36 bp，編碼111個(gè)氨基酸。在高氧環(huán)境下，氧與鐵反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生氧自由基，對植物產(chǎn)生巨大的毒性而損害生物有機(jī)體［28］。而鐵蛋白具有很強(qiáng)的貯鐵功能，可以將鐵以無毒的形式貯存起來，為依賴于鐵的生理生化過程起著暫時(shí)性緩沖作用，減少植物體內(nèi)各種氧化脅迫產(chǎn)生的傷害作用，增強(qiáng)植株對逆境脅迫的抗性，提高植物的生長速度［29］。Northem雜交的結(jié)果表明，鹽堿脅迫后，這2個(gè)基因都有不同程度的表達(dá)，但是隨著處理時(shí)間的延長，DHAR的表達(dá)量先增加后減少，而鐵蛋白的表達(dá)量持續(xù)增加。隨著處理濃度的遞增，DHAR的表達(dá)量變化不大，而鐵蛋白的表達(dá)量在200 mmol／L處理后達(dá)到最大，并且堿茅地上部與根部對脅迫響應(yīng)也存在時(shí)空上的差異［26］。說明同一植物不同基因以及同一基因在堿茅不同部位對鹽堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制是不同的，它們之間可能相輔相成，也可能相互制約。今后，應(yīng)該注重不同耐鹽堿基因之間互作效應(yīng)的研究。

2.2 抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因

作為抗氧化系統(tǒng)中清除鹽堿脅迫產(chǎn)生的H2O2的主要酶類——抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）［30］，它催化H2O2還原為H2O的反應(yīng)，對抗壞血酸具有很高的特異親和性［31］。它的基因在堿茅中也得到分離克?。?2］。序列分析表明，開放讀碼框（ORF）為876 bp，編碼291個(gè)氨基酸。它是細(xì)胞質(zhì)過氧化物體的分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中合成，最后通過蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)定位于過氧化物體。過量表達(dá)PutAPX基因的酵母在含H2O2的SD培養(yǎng)基上生長良好，對組織和細(xì)胞起到了保護(hù)作用，體現(xiàn)了抗壞血酸過氧化物酶在氧化脅迫下的作用。為進(jìn)一步研究APX在堿茅體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及逆境誘導(dǎo)下氧化脅迫的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

2.3 超氧化物歧化酶（SOD）基因

超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）是一種含金屬的抗氧化酶。對于清除氧自由基，防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用［33］，與植物的抗旱、抗鹽堿、耐高溫等多種逆境有密切關(guān)系［34］，主要可分為3類：Cu／Zn－SOD、Mn－SOD和Fe－SOD［35］。吳建慧等［36］從堿茅根c DNA文庫中分離得到Put－Cu／Zn－SOD基因，全長cDNA，開放讀碼框長615 bp，所編碼的蛋白由204個(gè)氨基酸組成。對轉(zhuǎn)Put－Cu／Zn－SOD酵母進(jìn)行鹽堿、氧化脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，堿茅Put－Cu／Zn－SOD基因?qū)a2CO3、Na HCO3和H2O2有著良好的抗性，顯著提高了酵母的抗鹽堿和耐氧化能力。也有一些研究表明，單個(gè)抗氧化脅迫基因的能力往往是有限的，所以要從堿茅中克隆更多的抗氧化脅迫基因，研究多個(gè)基因在增強(qiáng)植物抗逆能力中的作用機(jī)理及應(yīng)用。

3 離子脅迫相關(guān)基因

植物消除離子脅迫主要有3種機(jī)制，即降低離子吸收、離子外排和離子區(qū)隔化［37，38］，這3種機(jī)制的關(guān)鍵在于一些離子通道蛋白和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對離子的選擇性吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)作用。目前，在堿茅中克隆到的編碼此類蛋白的功能基因主要與 HKT（high－affinity K＋transporter）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、NHX（Na＋／H＋exchanger）逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、CAX（Ca2＋／H＋exchanger）反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和質(zhì)子泵蛋白的作用有關(guān)。

3.1 Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NHX）

植物Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na＋／H＋exchanger，NHX）分為質(zhì)膜型和液泡膜型2類，依靠H＋－ATPase和H＋－PPase產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力介導(dǎo)Na＋／H＋跨膜運(yùn)輸，分別負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na＋外排和Na＋區(qū)隔化，可以調(diào)節(jié)植物的耐鹽能力［39］。程玉祥［40］分離了堿茅質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（PtSOS1），Southern分析表明PtSOS1是單拷貝基因。半定量RT－PCR結(jié)果顯示，PtSOS1受鹽脅迫上調(diào)表達(dá)。說明PtSOS1可能在星星草（Puccinelliatenuiflora）的抗鹽堿能力中起作用。也有研究表明PtSOS1在擬南芥（Arabidopsisthaliana）中的過表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性［41］。但是堿茅質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否參與了體內(nèi)K＋的運(yùn)輸，與水稻（Oryzasativa）、擬南芥等植物的運(yùn)轉(zhuǎn)功能是否相同，還不清楚?？梢圆捎眠^表達(dá)PtSOS1和反義RNA擬制表達(dá)的方法來研究它的結(jié)構(gòu)與功能。

3.2 Ca2＋／H＋反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（CAX）

Ca2＋／H＋反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Ca2＋／H＋exchanger，CAX）與Ca2＋－ATP酶同是Ca2＋外向轉(zhuǎn)運(yùn)器，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中的Ca2＋運(yùn)出細(xì)胞，或運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的液泡及其他細(xì)胞器［42］。CAX是 Ca2＋／cation反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Ca2＋／cation antiporter，CaCA）的家族之一，在植物、真菌、細(xì)菌和低等脊椎動(dòng)物中均有存在。它是不直接需求三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的次級轉(zhuǎn)運(yùn)器，利用質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力（pmf）來驅(qū)動(dòng)鈣離子的運(yùn)輸［43］，對植物體內(nèi)的離子平衡有著極其重要的作用。Liu等［44］在堿茅中分離到的PutCAX基因，具有提高酵母對Ca2＋或Ba2＋抗性的功能，并且首次提出CAX基因具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)Ba2＋的功能。通過GFP熒光蛋白標(biāo)記和FM4－64（分子探針）染色，初步證明PutCAX定位于釀酒酵母的液泡膜上。通過觀察PutCAX基因N、C端缺失酵母轉(zhuǎn)化體的生長情況，發(fā)現(xiàn)N端和C端對PutCAX運(yùn)輸Ca2＋或Ba2＋具有一定的調(diào)控作用。但是，在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)PutCAX擬南芥植株的生長反而受到擬制，是不是由于PutCAX的過表達(dá)，打破了擬南芥體內(nèi)原有的離子平衡穩(wěn)態(tài)，還是與其他重金屬離子產(chǎn)生了離子拮抗作用，值得做進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

3.3 Na＋／K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（HKT）

植物HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（high－affinity K＋transporter）的主要功能是參與Na＋／K＋在植物體內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，已有的研究結(jié)果表明K＋／Na＋在細(xì)胞內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，是堿茅體內(nèi)一個(gè)非常重要的耐鹽機(jī)制［17］，說明堿茅HKT基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因工程中可能具有重大應(yīng)用價(jià)值。植物HKT蛋白的一些跨膜區(qū)和螺旋區(qū)的氨基酸組成是非常保守的［45］，這為利用同源克隆方法分離植物的HKT基因提供了方便。但是HKT基因在總體上的保守性比較差，即使單個(gè)氨基酸殘基的變化也會(huì)顯著改變選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)Na＋的活性［46］。因此Ardie等［47］將從堿茅中分離的PutHKT2與水稻中克隆的OsHKT2同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥，來研究2個(gè)HKT基因的表達(dá)差異性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)堿茅PutHKT2基因的酵母表現(xiàn)出高親和性的K＋－Na＋共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)PutHKT2擬南芥可以抵抗外界Na＋、K＋和Li＋多種離子的脅迫，而轉(zhuǎn)OsHKT2擬南芥僅僅對外界Na＋表現(xiàn)敏感。這也許是堿茅比水稻更耐鹽堿的原因之一。此外，同一蛋白家族的基因，表達(dá)效果也不盡相同。Zhang等［48］對堿茅質(zhì)膜家族蛋白3（plasma membrane protein 3）的2個(gè)基因PutPMP3－1、PutPMP3－2的研究發(fā)現(xiàn)，后者的抗逆能力更強(qiáng)。

4 參與脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因

干旱、鹽堿、低溫等外界逆境因子實(shí)質(zhì)上是一種體外信號，當(dāng)植物感知體外信號后，可以引發(fā)一系列的體內(nèi)信號，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的改變。在長期進(jìn)化過程中，植物擁有完整的信號網(wǎng)絡(luò)用以調(diào)節(jié)各種環(huán)境脅迫引起的響應(yīng)。隨著研究的逐步深入，脫落酸（ABA）被普遍認(rèn)為參與了在鹽脅迫下的滲透脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相應(yīng)地，調(diào)控ABA信號響應(yīng)基因的表達(dá)也被證實(shí)有助于提高植物的耐鹽性［49］。ABA可以引起氣孔的關(guān)閉，維持植物體內(nèi)水分平衡，保護(hù)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能，提高植物的抗鹽能力［50］。于雪飛和楊傳平［51］在堿茅中分離到受ABA和高鹽誘導(dǎo)的Put－R40g3基因，全長588 bp，編碼195個(gè)氨基酸，與水稻，小麥和擬南芥的氨基酸序列有較高的同源性，綠色熒光蛋白（GFP）定位研究結(jié)果顯示Put－R40g3蛋白存在于酵母細(xì)胞質(zhì)中。顯著提高了酵母對鹽、干旱及氧化等逆境條件的適應(yīng)能力。

除了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之外，植物還有很多響應(yīng)鹽脅迫的信號途徑。已經(jīng)證實(shí)鹽過敏感（salt overly sensitive，SOS）信號途徑在植物耐鹽中起調(diào)控作用，在這條途徑中，鈣離子作為第2信使與鈣離子結(jié)合蛋白結(jié)合并激活下游一系列蛋白，進(jìn)而調(diào)控植物的耐鹽性［52，53］。此外，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化也是調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)各種外源信號的重要機(jī)制，MAP激酶（促分裂原活化蛋白激酶）級聯(lián)途徑在內(nèi)源、外源信號傳導(dǎo)過程中均發(fā)揮著重要的作用。MAP激酶級聯(lián)途徑包括3種蛋白激酶：MAPKK激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和 MAP激酶（MAPK），構(gòu)成三級激酶模式［54－56］。

大量的證據(jù)表明，這些脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間存在聯(lián)系和交叉作用。鹽脅迫的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件以及早期誘導(dǎo)表達(dá)的基因是一個(gè)關(guān)鍵所在，分離堿茅體內(nèi)此類脅迫響應(yīng)基因是今后植物耐鹽性研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。在鹽堿脅迫下，堿茅體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞受體是什么？從堿茅感知脅迫信號到合成相關(guān)基因的表達(dá)蛋白，具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是什么？這些問題的解決將有助于加深對堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究。

5 基因組學(xué)在堿茅耐鹽堿機(jī)理研究中的應(yīng)用

隨著植物基因組學(xué)與生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，為堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究及相關(guān)基因的克隆提供了許多新的技術(shù)，如：差異顯示（DDRT）、擬制性消減雜交（SSH）、c DNA微陣列技術(shù)（c DNA microarray）和表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等。已有許多學(xué)者應(yīng)用其中一種，或是幾種技術(shù)相結(jié)合的方法，對不同濃度、不同時(shí)間鹽堿脅迫處理下，堿茅相關(guān)基因的表達(dá)情況，作了詳細(xì)的研究［57－60］。其中已知的同源EST序列，大多數(shù)是與活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)、基因調(diào)控、離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)的基因片段。DNA芯片（DNA chip）的研究結(jié)果顯示，一些基因在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)，另一些基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，這些基因的功能主要涉及了信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞防御、細(xì)胞代謝等方面，這些差異表達(dá)的基因可能在星星草抗鹽堿過程中具有關(guān)鍵作用。植物的抗鹽堿過程是一個(gè)復(fù)雜的多因子作用體系［61］，通過新興的基因組學(xué)研究手段，可以有效獲取鹽堿脅迫下堿茅基因表達(dá)的大量特征信息，從而為系統(tǒng)闡明堿茅抗鹽堿分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為尋找未知的抗逆基因提供了新途徑。

表1 NCBI基因庫中已登錄的堿茅鹽堿誘導(dǎo)基因或片段Table 1 The salt and alkali inducible gene or cDNA segment registered in Gene bank

6 問題與展望

目前，在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫中登錄的與堿茅鹽堿誘導(dǎo)相關(guān)的基因或片段總共有17種（表1）。不得不承認(rèn)我國牧草分子生物學(xué)的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于水稻、小麥等農(nóng)作物的研究［62－64］。但是，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的首要逆境脅迫就是土壤鹽漬化，而培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物有望解決這一世界難題。分子選育抗鹽堿植物新品種的關(guān)鍵，就是從鹽生植物里分離抗鹽堿功能基因，堿茅，作為一種寶貴的鹽生種質(zhì)資源、為相關(guān)研究提供了豐富的耐鹽堿基因。加大對堿茅分子生物學(xué)的研究，不僅有助于培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、牧草和花卉，而且可以為我國鹽堿草地的改良和治理提供理論基礎(chǔ)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)。

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