堿茅耐鹽堿基因克隆研究進(jìn)展

任偉，王志峰，徐安凱

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺136100）

堿茅（Puccinellia）是生長在草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍的冷季型多年生禾本科牧草。它的幼苗，在p H值大于10、表土含鹽量5%以上的土壤中，仍能正常生長，被譽(yù)為鹽堿地的先鋒植物［1］。作為一種抗鹽堿、耐低溫、飼用價(jià)值好的優(yōu)良牧草，引起了諸多學(xué)者的重視。以往的科技工作者對(duì)堿茅在鹽堿脅迫下的生理生化反應(yīng)［2－6］、種子萌發(fā)［7－9］、形態(tài)解剖［10－12］、耐鹽機(jī)制［13－17］、遺傳育種及鹽堿地生態(tài)恢復(fù)與改良［18－20］等方面做了詳細(xì)的研究。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，許多新的技術(shù)如分子克隆、分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、差異顯示（DDRT）、擬制性消減雜交（SSH）、c DNA微陣列技術(shù)（c DNA microarray）、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等廣泛應(yīng)用于堿茅耐鹽機(jī)理的研究，取得許多重要的研究成果。獲得了大量的鹽堿誘導(dǎo)基因，主要集中在鹽堿脅迫條件下，與其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、抗氧化保護(hù)酶、離子通道蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白作用有關(guān)的基因。對(duì)堿茅耐鹽堿基因的挖掘，不僅有助于更好的研究堿茅自身的耐鹽堿機(jī)制，而且可以加快牧草及其他農(nóng)作物的品質(zhì)改良，具有重要的理論意義和很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成基因

當(dāng)植物遭遇干旱、鹽堿、低溫等逆境時(shí)，就會(huì)在體內(nèi)積累各種小分子物質(zhì)，提高細(xì)胞液濃度，降低其滲透勢，并保持一定的壓力勢，來維持細(xì)胞的正常膨壓。參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)有很多，大致可分為兩大類。一類是由外界進(jìn)入細(xì)胞的無機(jī)離子，一類是在細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì)，如脯氨酸（proline）、甜菜堿（betaine）、芒柄醇（D－ononitol）、甘露醇（mannitol）、山梨醇（sorbitol）和海藻糖（trehalose）等。

目前，從植物中克隆的參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的基因主要是BADH基因（甜菜堿醛脫氫酶基因，betaine aldehyde dehydragenase）、P5CS基因（Δ’－吡咯啉－5－羧酸合成酶基因，Δ’－pyrroline－5－carboxylate synthase）［21］和Imtl基因（肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因，inositol O－methyltrans ferase）［22］。其中BADH基因是目前耐鹽、耐旱基因工程中研究得較深入的基因之一，是公認(rèn)的截至目前為止，最具抗鹽堿效果的基因。楊錚等［23］和鐘鳴等［24］通過同源序列克隆結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE），在朝鮮堿茅中擴(kuò)增出BADH基因，共1 502 bp。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，朝鮮堿茅與大麥（Hordeumbrevisubulatum）、羊草（Leymuschinensis）的同源性高達(dá)89%，含有醛脫氫酶特有的十肽保守序列（VSLELGGKSP），但是與多數(shù)植物中BADH的十肽保守序列（VTLELGGKSP）存在細(xì)微的差別，朝鮮堿茅第2位的T被S取代。其后29位點(diǎn)上含有與酶功能有關(guān)的半胱氨酸殘基，可能包含NAD＋結(jié)合位點(diǎn)及酶催化位點(diǎn)，這些微小的變化及內(nèi)含的結(jié)合位點(diǎn)可能與增強(qiáng)堿茅的耐鹽能力有關(guān)。C末端的SKL信號(hào)肽序列，說明甜菜堿醛脫氫酶定位于朝鮮堿茅體內(nèi)的過氧化物酶體中，而甜菜堿的合成是在葉綠體中完成，朝鮮堿茅是如何完成這個(gè)運(yùn)輸過程的，會(huì)不會(huì)影響它的耐鹽能力，以及這個(gè)BADH基因的耐鹽生理特性如何，都值得做進(jìn)一步的研究。

2 抗氧化脅迫基因

鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生氧自由基（O2－）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（OH－）等活性氧物質(zhì)（ROS），引起膜脂過氧化，蛋白質(zhì)變性，核酸降解，進(jìn)而導(dǎo)致氧化脅迫的產(chǎn)生。植物有2種防止活性氧危害的系統(tǒng)：酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。非酶促系統(tǒng)主要包括一些直接參與活性氧清除的抗氧化物，如抗壞血酸、谷胱甘肽、多元醇、α－生育酚、類胡蘿卜素和黃酮等。酶促系統(tǒng)是指參與保護(hù)反應(yīng)的酶類，主要有超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT），抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX），谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPX），谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione s－transferase，GST），單脫氧抗壞血酸還原酶（monodehydro aseorbate reduetase，MDHAR）及脫氧抗壞血酸還原酶（dehydroascorbic acid reductase，DHAR）等［25］。在堿茅中，目前研究比較多的是酶促系統(tǒng)中的一些關(guān)鍵酶類。

2.1 脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）基因和鐵蛋白（Fer）基因

張曉磊［26］根據(jù)已有的堿茅EST片段設(shè)計(jì)基因特異性引物，克隆到了脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)er）2個(gè)抗氧化基因，并研究了不同鹽堿處理?xiàng)l件下這2個(gè)基因的表達(dá)變化情況。PtDHAR基因，開放閱讀框（ORF）639 bp，編碼213個(gè)氨基酸，以谷胱甘肽為底物，催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸，在保護(hù)細(xì)胞組分抵御氧化損傷及循環(huán)利用抗壞血酸中起重要作用［27］。鐵蛋白（PtFer）基因開放閱讀框?yàn)?36 bp，編碼111個(gè)氨基酸。在高氧環(huán)境下，氧與鐵反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生氧自由基，對(duì)植物產(chǎn)生巨大的毒性而損害生物有機(jī)體［28］。而鐵蛋白具有很強(qiáng)的貯鐵功能，可以將鐵以無毒的形式貯存起來，為依賴于鐵的生理生化過程起著暫時(shí)性緩沖作用，減少植物體內(nèi)各種氧化脅迫產(chǎn)生的傷害作用，增強(qiáng)植株對(duì)逆境脅迫的抗性，提高植物的生長速度［29］。Northem雜交的結(jié)果表明，鹽堿脅迫后，這2個(gè)基因都有不同程度的表達(dá)，但是隨著處理時(shí)間的延長，DHAR的表達(dá)量先增加后減少，而鐵蛋白的表達(dá)量持續(xù)增加。隨著處理濃度的遞增，DHAR的表達(dá)量變化不大，而鐵蛋白的表達(dá)量在200 mmol／L處理后達(dá)到最大，并且堿茅地上部與根部對(duì)脅迫響應(yīng)也存在時(shí)空上的差異［26］。說明同一植物不同基因以及同一基因在堿茅不同部位對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)機(jī)制是不同的，它們之間可能相輔相成，也可能相互制約。今后，應(yīng)該注重不同耐鹽堿基因之間互作效應(yīng)的研究。

2.2 抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因

作為抗氧化系統(tǒng)中清除鹽堿脅迫產(chǎn)生的H2O2的主要酶類——抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）［30］，它催化H2O2還原為H2O的反應(yīng)，對(duì)抗壞血酸具有很高的特異親和性［31］。它的基因在堿茅中也得到分離克?。?2］。序列分析表明，開放讀碼框（ORF）為876 bp，編碼291個(gè)氨基酸。它是細(xì)胞質(zhì)過氧化物體的分泌蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中合成，最后通過蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)定位于過氧化物體。過量表達(dá)PutAPX基因的酵母在含H2O2的SD培養(yǎng)基上生長良好，對(duì)組織和細(xì)胞起到了保護(hù)作用，體現(xiàn)了抗壞血酸過氧化物酶在氧化脅迫下的作用。為進(jìn)一步研究APX在堿茅體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及逆境誘導(dǎo)下氧化脅迫的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

2.3 超氧化物歧化酶（SOD）基因

超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）是一種含金屬的抗氧化酶。對(duì)于清除氧自由基，防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有十分重要的作用［33］，與植物的抗旱、抗鹽堿、耐高溫等多種逆境有密切關(guān)系［34］，主要可分為3類：Cu／Zn－SOD、Mn－SOD和Fe－SOD［35］。吳建慧等［36］從堿茅根c DNA文庫中分離得到Put－Cu／Zn－SOD基因，全長cDNA，開放讀碼框長615 bp，所編碼的蛋白由204個(gè)氨基酸組成。對(duì)轉(zhuǎn)Put－Cu／Zn－SOD酵母進(jìn)行鹽堿、氧化脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，堿茅Put－Cu／Zn－SOD基因?qū)a2CO3、Na HCO3和H2O2有著良好的抗性，顯著提高了酵母的抗鹽堿和耐氧化能力。也有一些研究表明，單個(gè)抗氧化脅迫基因的能力往往是有限的，所以要從堿茅中克隆更多的抗氧化脅迫基因，研究多個(gè)基因在增強(qiáng)植物抗逆能力中的作用機(jī)理及應(yīng)用。

3 離子脅迫相關(guān)基因

植物消除離子脅迫主要有3種機(jī)制，即降低離子吸收、離子外排和離子區(qū)隔化［37，38］，這3種機(jī)制的關(guān)鍵在于一些離子通道蛋白和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)離子的選擇性吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)作用。目前，在堿茅中克隆到的編碼此類蛋白的功能基因主要與 HKT（high－affinity K＋transporter）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、NHX（Na＋／H＋exchanger）逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、CAX（Ca2＋／H＋exchanger）反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和質(zhì)子泵蛋白的作用有關(guān)。

3.1 Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NHX）

植物Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na＋／H＋exchanger，NHX）分為質(zhì)膜型和液泡膜型2類，依靠H＋－ATPase和H＋－PPase產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力介導(dǎo)Na＋／H＋跨膜運(yùn)輸，分別負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na＋外排和Na＋區(qū)隔化，可以調(diào)節(jié)植物的耐鹽能力［39］。程玉祥［40］分離了堿茅質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（PtSOS1），Southern分析表明PtSOS1是單拷貝基因。半定量RT－PCR結(jié)果顯示，PtSOS1受鹽脅迫上調(diào)表達(dá)。說明PtSOS1可能在星星草（Puccinelliatenuiflora）的抗鹽堿能力中起作用。也有研究表明PtSOS1在擬南芥（Arabidopsisthaliana）中的過表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性［41］。但是堿茅質(zhì)膜型Na＋／H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否參與了體內(nèi)K＋的運(yùn)輸，與水稻（Oryzasativa）、擬南芥等植物的運(yùn)轉(zhuǎn)功能是否相同，還不清楚?？梢圆捎眠^表達(dá)PtSOS1和反義RNA擬制表達(dá)的方法來研究它的結(jié)構(gòu)與功能。

3.2 Ca2＋／H＋反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（CAX）

Ca2＋／H＋反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Ca2＋／H＋exchanger，CAX）與Ca2＋－ATP酶同是Ca2＋外向轉(zhuǎn)運(yùn)器，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中的Ca2＋運(yùn)出細(xì)胞，或運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的液泡及其他細(xì)胞器［42］。CAX是 Ca2＋／cation反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Ca2＋／cation antiporter，CaCA）的家族之一，在植物、真菌、細(xì)菌和低等脊椎動(dòng)物中均有存在。它是不直接需求三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)器，利用質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力（pmf）來驅(qū)動(dòng)鈣離子的運(yùn)輸［43］，對(duì)植物體內(nèi)的離子平衡有著極其重要的作用。Liu等［44］在堿茅中分離到的PutCAX基因，具有提高酵母對(duì)Ca2＋或Ba2＋抗性的功能，并且首次提出CAX基因具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)Ba2＋的功能。通過GFP熒光蛋白標(biāo)記和FM4－64（分子探針）染色，初步證明PutCAX定位于釀酒酵母的液泡膜上。通過觀察PutCAX基因N、C端缺失酵母轉(zhuǎn)化體的生長情況，發(fā)現(xiàn)N端和C端對(duì)PutCAX運(yùn)輸Ca2＋或Ba2＋具有一定的調(diào)控作用。但是，在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)PutCAX擬南芥植株的生長反而受到擬制，是不是由于PutCAX的過表達(dá)，打破了擬南芥體內(nèi)原有的離子平衡穩(wěn)態(tài)，還是與其他重金屬離子產(chǎn)生了離子拮抗作用，值得做進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

3.3 Na＋／K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（HKT）

植物HKT家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（high－affinity K＋transporter）的主要功能是參與Na＋／K＋在植物體內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，已有的研究結(jié)果表明K＋／Na＋在細(xì)胞內(nèi)的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)，是堿茅體內(nèi)一個(gè)非常重要的耐鹽機(jī)制［17］，說明堿茅HKT基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因工程中可能具有重大應(yīng)用價(jià)值。植物HKT蛋白的一些跨膜區(qū)和螺旋區(qū)的氨基酸組成是非常保守的［45］，這為利用同源克隆方法分離植物的HKT基因提供了方便。但是HKT基因在總體上的保守性比較差，即使單個(gè)氨基酸殘基的變化也會(huì)顯著改變選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)Na＋的活性［46］。因此Ardie等［47］將從堿茅中分離的PutHKT2與水稻中克隆的OsHKT2同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母和擬南芥，來研究2個(gè)HKT基因的表達(dá)差異性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)堿茅PutHKT2基因的酵母表現(xiàn)出高親和性的K＋－Na＋共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)PutHKT2擬南芥可以抵抗外界Na＋、K＋和Li＋多種離子的脅迫，而轉(zhuǎn)OsHKT2擬南芥僅僅對(duì)外界Na＋表現(xiàn)敏感。這也許是堿茅比水稻更耐鹽堿的原因之一。此外，同一蛋白家族的基因，表達(dá)效果也不盡相同。Zhang等［48］對(duì)堿茅質(zhì)膜家族蛋白3（plasma membrane protein 3）的2個(gè)基因PutPMP3－1、PutPMP3－2的研究發(fā)現(xiàn)，后者的抗逆能力更強(qiáng)。

4 參與脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因

干旱、鹽堿、低溫等外界逆境因子實(shí)質(zhì)上是一種體外信號(hào)，當(dāng)植物感知體外信號(hào)后，可以引發(fā)一系列的體內(nèi)信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的改變。在長期進(jìn)化過程中，植物擁有完整的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)用以調(diào)節(jié)各種環(huán)境脅迫引起的響應(yīng)。隨著研究的逐步深入，脫落酸（ABA）被普遍認(rèn)為參與了在鹽脅迫下的滲透脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相應(yīng)地，調(diào)控ABA信號(hào)響應(yīng)基因的表達(dá)也被證實(shí)有助于提高植物的耐鹽性［49］。ABA可以引起氣孔的關(guān)閉，維持植物體內(nèi)水分平衡，保護(hù)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能，提高植物的抗鹽能力［50］。于雪飛和楊傳平［51］在堿茅中分離到受ABA和高鹽誘導(dǎo)的Put－R40g3基因，全長588 bp，編碼195個(gè)氨基酸，與水稻，小麥和擬南芥的氨基酸序列有較高的同源性，綠色熒光蛋白（GFP）定位研究結(jié)果顯示Put－R40g3蛋白存在于酵母細(xì)胞質(zhì)中。顯著提高了酵母對(duì)鹽、干旱及氧化等逆境條件的適應(yīng)能力。

除了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之外，植物還有很多響應(yīng)鹽脅迫的信號(hào)途徑。已經(jīng)證實(shí)鹽過敏感（salt overly sensitive，SOS）信號(hào)途徑在植物耐鹽中起調(diào)控作用，在這條途徑中，鈣離子作為第2信使與鈣離子結(jié)合蛋白結(jié)合并激活下游一系列蛋白，進(jìn)而調(diào)控植物的耐鹽性［52，53］。此外，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化也是調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)各種外源信號(hào)的重要機(jī)制，MAP激酶（促分裂原活化蛋白激酶）級(jí)聯(lián)途徑在內(nèi)源、外源信號(hào)傳導(dǎo)過程中均發(fā)揮著重要的作用。MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑包括3種蛋白激酶：MAPKK激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和 MAP激酶（MAPK），構(gòu)成三級(jí)激酶模式［54－56］。

大量的證據(jù)表明，這些脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間存在聯(lián)系和交叉作用。鹽脅迫的早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件以及早期誘導(dǎo)表達(dá)的基因是一個(gè)關(guān)鍵所在，分離堿茅體內(nèi)此類脅迫響應(yīng)基因是今后植物耐鹽性研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。在鹽堿脅迫下，堿茅體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞受體是什么？從堿茅感知脅迫信號(hào)到合成相關(guān)基因的表達(dá)蛋白，具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是什么？這些問題的解決將有助于加深對(duì)堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究。

5 基因組學(xué)在堿茅耐鹽堿機(jī)理研究中的應(yīng)用

隨著植物基因組學(xué)與生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，為堿茅耐鹽堿機(jī)理的研究及相關(guān)基因的克隆提供了許多新的技術(shù)，如：差異顯示（DDRT）、擬制性消減雜交（SSH）、c DNA微陣列技術(shù)（c DNA microarray）和表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）等。已有許多學(xué)者應(yīng)用其中一種，或是幾種技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)不同濃度、不同時(shí)間鹽堿脅迫處理下，堿茅相關(guān)基因的表達(dá)情況，作了詳細(xì)的研究［57－60］。其中已知的同源EST序列，大多數(shù)是與活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)、基因調(diào)控、離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)的基因片段。DNA芯片（DNA chip）的研究結(jié)果顯示，一些基因在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)，另一些基因在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，這些基因的功能主要涉及了信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞防御、細(xì)胞代謝等方面，這些差異表達(dá)的基因可能在星星草抗鹽堿過程中具有關(guān)鍵作用。植物的抗鹽堿過程是一個(gè)復(fù)雜的多因子作用體系［61］，通過新興的基因組學(xué)研究手段，可以有效獲取鹽堿脅迫下堿茅基因表達(dá)的大量特征信息，從而為系統(tǒng)闡明堿茅抗鹽堿分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為尋找未知的抗逆基因提供了新途徑。

表1 NCBI基因庫中已登錄的堿茅鹽堿誘導(dǎo)基因或片段Table 1 The salt and alkali inducible gene or cDNA segment registered in Gene bank

6 問題與展望

目前，在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫中登錄的與堿茅鹽堿誘導(dǎo)相關(guān)的基因或片段總共有17種（表1）。不得不承認(rèn)我國牧草分子生物學(xué)的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于水稻、小麥等農(nóng)作物的研究［62－64］。但是，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的首要逆境脅迫就是土壤鹽漬化，而培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物有望解決這一世界難題。分子選育抗鹽堿植物新品種的關(guān)鍵，就是從鹽生植物里分離抗鹽堿功能基因，堿茅，作為一種寶貴的鹽生種質(zhì)資源、為相關(guān)研究提供了豐富的耐鹽堿基因。加大對(duì)堿茅分子生物學(xué)的研究，不僅有助于培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、牧草和花卉，而且可以為我國鹽堿草地的改良和治理提供理論基礎(chǔ)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)。

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