復雜鹽堿對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響及機理初探

馮建永，龐民好，張金林，劉穎超

（河北農業(yè)大學植物保護學院，河北 保定071000）

黃頂菊（Flaveriabidentis）是近年來新發(fā)現的一種外來入侵植物，屬于菊科堆心菊族黃菊屬［1］。作為外來入侵生物，黃頂菊具有繁殖率高，擴展蔓延速度快，對引入地適應性強等特點，自從2001年在衡水湖首次發(fā)現，在很短的時間內度過了適應期，依靠其繁殖優(yōu)勢和擴張能力，大量繁殖迅速生長，很快擠入了生態(tài)系統(tǒng)，占據重要生態(tài)位，擾亂生態(tài)系統(tǒng)原有的食物鏈條和系統(tǒng)內的物流和能流秩序，對我國的生態(tài)安全造成了嚴重的威脅。2007年黃頂菊已列為我國的對外檢疫對象。

黃頂菊具有廣泛的適應性和極強的生命力，根據黃頂菊原產地及其傳播入侵區(qū)域的生態(tài)環(huán)境條件，可以判定黃頂菊在我國的適宜生長區(qū)域遠遠不僅局限于目前已知道的天津、河北等地，我國的華北、華中、華東、華南及沿海地區(qū)都有可能成為黃頂菊入侵的重點區(qū)域［2］。因為入侵時間不很長，目前國內對于黃頂菊的研究主要集中在形態(tài)特征、生物學特性、生理特征［2］、入侵途徑［3］、傳播及對生態(tài)環(huán)境的影響［4］、化感作用［5］、藥劑防治［6］等方面；國外Moran Lemir［7］研究了黃頂菊基本概況和其生物防治的可能性。介紹了黃頂菊作為雜草在阿根廷的分布和蔓延。研究了黃頂菊的形態(tài)學，分類學，繁殖特性以及抑制種子萌發(fā)的因素。Guglielmone等［8，9］對黃頂菊的次生代謝產物黃酮硫酸鹽對血小板的凝集作用、抗凝血效果和作用機制進行了研究。還有大量的研究集中在黃頂菊體內C4重要光合酶［10，11］、C4途徑演化［12，13］等方面。黃頂菊種子產量大，其入侵和傳播主要通過種子進行，而種子的萌發(fā)對種群個體的繁殖、種群的擴展及抵御不良環(huán)境有著重要意義［14］。文獻報道黃頂菊是一種喜光、喜濕、嗜鹽的植物，喜生于富含礦物質及鹽分的生境［2］，王貴啟等［15］研究了光照、溫度、土壤含水量和空氣相對濕度對黃頂菊種子萌發(fā)的影響，任艷萍等［16］從溫度、光照、NaCl脅迫及浸種等方面對黃頂菊種子萌發(fā)特性進行了探討。但關于復雜鹽堿條件對黃頂菊生長的影響及其耐鹽機理國內尚無研究報道。鑒于黃頂菊目前的發(fā)生分布主要集中在河北省及與河北省相鄰的天津、河南、山東等個別地區(qū)，本研究將2種中性鹽NaCl、Na2SO4及2種堿性鹽Na2CO3、Na HCO3按不同比例混合，模擬出24種與河北省天然鹽堿生態(tài)條件基本一致的復雜鹽堿條件，對黃頂菊種子進行處理，旨在探討復雜鹽堿條件對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，同時測定了黃頂菊幼苗受到復雜鹽堿脅迫后葉片葉綠素、丙二醛含量及抗氧化酶活性的變化，對其耐鹽堿機理進行了初步探討。從黃頂菊對鹽堿脅迫的反應機制方面探討其生態(tài)適應性和入侵機制，為黃頂菊資源利用和控制其蔓延提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃頂菊種子采自河北省衡水湖。

1.2 處理溶液配制

鹽溶液的配制參照楊春武等［17］的方法并加以改進，將2種中性鹽 NaCl、Na2SO4及2種堿性鹽Na2CO3、Na HCO3按不同比例混合，模擬出河北省主要的4種鹽堿地成分組成［18，19］。按堿度由大到小的順序分成A、B、C和D 4個處理組。每組設6個濃度處理。其總鹽濃度依次為50，100，150，200，250和300 mmol／L。分別以各濃度標識。如A50即表示A組內鹽濃度為50 mmol／L的處理，依次類推，總計為24種處理，各處理的鹽分組成比例見表1，所涉及的主要脅迫因素及其強度見表2。

表1 各處理所含鹽分及其摩爾比Table 1 Salt composition and its molar ratio of various treatments

1.3 種子處理

挑選飽滿的黃頂菊種子，用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒，蒸餾水反復沖洗干凈后供試驗用。將24種處理液分別加到鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿（d＝9 cm）中，直至濾紙飽和，每個培養(yǎng)皿中均勻放入100粒黃頂菊種子。每個處理4次重復。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，控制溫度為（30±1）℃，光照為14 h（2 500 lx）／10 h（黑暗）交替。試驗期間，用相對應的鹽溶液來補充水分，始終保持濾紙濕潤而無明水，每天統(tǒng)計各處理的種子發(fā)芽數。處理后第10天計算各處理的發(fā)芽率和發(fā)芽指數，測量幼苗的高度和根長。發(fā)芽結束后，將未萌動的種子用蒸餾水沖洗干凈后，移入蒸餾水中，在同樣的溫度和光照條件下使之繼續(xù)萌發(fā)，10 d后統(tǒng)計發(fā)芽率。

式中，n為萌發(fā)處理后第10天的萌發(fā)種子粒數，N為供試種子數。Gt為在t天的種子發(fā)芽數，Dt為相對應的種子發(fā)芽天數。

1.4 致脅變因素分析

各處理溶液的鹽度及Cl－、SO42－、HCO3－、CO32－等離子的濃度根據處理液的實際濃度及比例算出。處理液的p H值，用數字p H計測定。用鹽酸滴定法測定各處理液的緩沖量，即用滴定法使1 L處理液的p H值降至與對照相等時所需H＋的mmol數［20］。用DPS v7.55版統(tǒng)計軟件進行數據的統(tǒng)計學分析。

1.5 黃頂菊對鹽堿脅迫的生理反應

在室內種植黃頂菊，待幼苗長至六葉一心期，分別用150 mmol／L的NaCl、復雜鹽堿A組合（簡稱“A”）和復雜鹽堿D組合（簡稱“D”）處理黃頂菊，在處理后12，24，48，72和96 h取樣，進行黃頂菊葉片生理指標的測定，測定時各樣品重復4次，以清水處理為對照。采用相對電導率法［21］測定細胞膜透性；葉綠素含量的測定參照王晶等［22］的方法；硫代巴比妥酸法［23］測定丙二醛含量；酶液提取參照 Asish等［24］的方法；氮藍四唑光化還原法［22］測定超氧化物歧化酶活性；愈創(chuàng)木酚法［22］測定過氧化物酶活性；過氧化氫酶活性參照宋鳳鳴等［25］的方法測定。

表2 各處理的脅迫因素數據Table 2 Data of stress factors for various treatments

2 結果與分析

2.1 混合鹽堿條件對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.1.1 混合鹽堿條件對黃頂菊種子萌發(fā)的影響 鹽濃度與A、B、C、D 4組的發(fā)芽率和發(fā)芽指數均表現為負效應，隨著鹽濃度的增加，各組的發(fā)芽率和發(fā)芽指數均呈下降趨勢，當鹽濃度達到300 mmol／L時各處理組的黃頂菊種子均不能萌發(fā)；鹽溶液堿性越強，發(fā)芽率和發(fā)芽指數下降幅度越大，如鹽濃度在100 mmol／L時，A處理的發(fā)芽率、發(fā)芽指數分別為50.24%和6.13，當鹽濃度達到150 mmol／L時，與鹽濃度為100 mmol／L相比A處理的發(fā)芽率、發(fā)芽指數分別下降了51.11%和70.31%；隨著A、B、C、D各處理堿性的增強，終止黃頂菊萌發(fā)的鹽濃度也有所降低，如A處理的鹽濃度在200 mmol／L時黃頂菊已經停止萌發(fā)，而B處理的鹽濃度在200 mmol／L時仍有近40%的黃頂菊能夠萌發(fā)，當鹽濃度在250 mmol／L時黃頂菊則停止萌發(fā)（圖1）。

2.1.2 混合鹽堿條件對黃頂菊幼苗生長的影響 混合鹽堿條件對黃頂菊幼苗生長的影響顯示（圖2），除D50處理的黃頂菊根長稍大于對照處理外，鹽濃度與A、B、C、D 4組處理的根長和莖高均表現為負效應。在相同鹽濃度的處理下，隨著鹽溶液堿性的降低各處理的根長和莖高均呈增大趨勢，如鹽濃度在100 mmol／L時A、B、C、D各處理的莖高分別為1.72，3.99，5.47和7.72 mm，差異達到顯著水平。

圖1 鹽濃度對黃頂菊種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of salinity on the germination of F.bidentis

圖2 鹽濃度對黃頂菊幼苗生長的影響Fig.2 Effects of salinity on the seedling growth of F.bidentis

2.2 解除鹽堿脅迫后黃頂菊種子的發(fā)芽率

解除鹽堿脅迫后，未萌發(fā)的黃頂菊種子仍能繼續(xù)萌發(fā)（圖3）。恢復發(fā)芽率隨著處理前鹽濃度的升高而增加，當鹽濃度＜150 mmol／L時，B、C、D各處理的恢復發(fā)芽率差異不顯著，但顯著低于A處理，當鹽濃度＞150 mmol／L時，B處理的恢復發(fā)芽率迅速升高，顯著高于C、D處理，當處理前鹽濃度為300 mmol／L時，各處理的恢復發(fā)芽率無明顯差異，均高于50%；在恢復萌發(fā)的過程中，C、D處理的萌發(fā)率差異不顯著。

2.3 各脅迫因素與黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的各指標的統(tǒng)計學分析

2.3.1 各脅迫因素與黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的各指標的相關性分析 黃頂菊的發(fā)芽率、發(fā)芽指數、根長、莖高與各脅迫因素均表現為負相關（表3）。鹽濃度、p H值、緩沖量、CO32－、HCO3－與發(fā)芽率相關均達極顯著水平（P＜0.01），SO42－與發(fā)芽率相關達顯著水平（P＜0.05），只有Cl－與發(fā)芽率相關不顯著。發(fā)芽指數與鹽濃度、p H值、緩沖量相關達極顯著水平（P＜0.01），與Cl－、SO42－、CO32－、HCO3－相關達顯著水平（P＜0.05）。莖高與鹽濃度、p H值相關達極顯著水平（P＜0.01），與緩沖量、SO42－、CO32－、HCO3－相關達顯著水平（P＜0.05），與Cl－相關不顯著。根長與鹽濃度、p H值相關達極顯著水平（P＜0.01），與Cl－、SO42－相關達顯著水平（P＜0.05），與緩沖量、CO32－、HCO3－相關不顯著。在7個脅迫因素中，鹽濃度和p H值與發(fā)芽率、發(fā)芽指數、莖高、根長之間相關均達極顯著水平（P＜0.01），其相關系數明顯大于其他5個脅迫因素?？梢婝}濃度和p H值對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響明顯大于緩沖量、Cl－、SO42－、CO32－、HCO3－等脅迫因素。同時，鹽濃度與黃頂菊各測定指標的相關系數均大于p H值與黃頂菊各測定指標的相關系數。

圖3 解除鹽堿脅迫后黃頂菊種子的發(fā)芽率Fig.3 The germination rate of F.bidentis released from salt and alkali stress

表3 各脅迫因素與黃頂菊各測定指標的相關系數Table 3 Correlation coefficients between the stress factors and index of F.bidentis

2.3.2 方差分析 處理組即本實驗設計的堿性鹽比例不同的A、B、C、D 4組，以堿性鹽比例即處理組代表堿脅迫強度，以每一處理組的總鹽濃度即鹽度代表其鹽脅迫強度，分別對黃頂菊發(fā)芽率、發(fā)芽指數、根長、莖高與鹽、堿脅迫之間的關系進行雙因素方差分析（表4）。表中F＝方差（MS）／誤差（error），F值越大差異越大。黃頂菊發(fā)芽率、發(fā)芽指數、根長、莖高的雙因素方差分析結果均表現為鹽濃度的F值遠大于處理組的F值，即鹽脅迫對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響遠大于堿脅迫。

2.4 黃頂菊對鹽堿脅迫的生理反應

2.4.1 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片膜透性的影響 在鹽脅迫處理12 h后，3種不同鹽比例脅迫處理的相對電導率均顯著大于對照處理（圖4），表明在鹽脅迫過程中黃頂菊的細胞膜遭到了破壞，細胞內含物外滲，使外滲液的電導度增大。而且隨著脅迫時間的延長，不同鹽脅迫處理的相對電導率逐漸增大，如在單鹽NaCl脅迫處理后12，24，48，72，96 h的相對電導率分別為37.37%，40.37%，45.23%，56.24%，59.21%。不同鹽比例脅迫處理相同時間，隨著處理堿度的增加相對電導率逐漸增加，如在脅迫處理后72 h，單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合的相對電導率分別為56.24%，57.89%，68.24%，分別比同時期對照增加了162.19%，169.88%，218.14%，但單鹽NaCl處理與復雜鹽堿D組合對黃頂菊葉片膜透性的影響差異不顯著。由此推測鹽堿脅迫均可增強黃頂菊的細胞膜透性，且堿脅迫的影響大于鹽脅迫。

2.4.2 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片葉綠素含量的影響 隨著脅迫時間的延長，3種不同鹽比例脅迫處理對黃頂菊葉片葉綠素的破壞率增大，如在復雜鹽堿D組合脅迫處理黃頂菊12，24，48，72，96 h后，其葉綠素相對破壞率分別為1.83%，4.60%，9.19%，10.26%，12.24%。不同鹽比例脅迫處理在相同脅迫時間下對葉綠素的相對破壞率隨著處理堿度的增加逐漸增加，如在脅迫處理后48 h單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合處理對黃頂菊葉片的相對破壞率分別為8.51%，9.19%，10.71%（圖5）。

表4 雙因素方差分析結果Table 4 Result of two－way variance analysis（ANOVA）

圖4 鹽脅迫對黃頂菊葉片膜透性的影響Fig.4 Effect of salt stress on electrolyte leakage of F.bidentis in leaves

圖5 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片葉綠素含量的影響Fig.5 Effect of saline－alkali stress on chlorophyll of F.bidentis in leaves

2.4.3 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片丙二醛含量的影響 在鹽堿脅迫處理24 h內，各處理的丙二醛含量差異不顯著，在處理后48 h內，單鹽NaCl脅迫處理丙二醛含量與對照差異不顯著。隨著脅迫時間的延長各處理丙二醛含量逐漸增加（圖6）。如在處理后96 h，單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合處理的丙二醛含量分別比對照處理高35.80%，51.14%，59.22%。不同鹽比例脅迫處理在相同脅迫時間下丙二醛含量也不同，隨著處理堿度的增加丙二醛的含量逐漸增加，如在脅迫處理后96 h，單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合處理的丙二醛含量分別為787.64，876.56，923.45μmol／g。由此可知，隨著鹽堿脅迫處理的時間延長，堿度的增加，對黃頂菊葉片的傷害程度越大。

2.4.4 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片抗氧化酶活性的影響 鹽堿脅迫處理后12 h內，SOD（圖7）的活性與對照相比沒有顯著差異，脅迫處理24 h后活性達到最高水平，顯著大于對照處理，如脅迫處理后24 h，單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合的SOD活性分別比對照處理高10.6%，26.8%和41.0%，24 h后二者活性逐漸降低，處理后96 h，酶活性低于對照處理。在相同的鹽脅迫濃度下，不同鹽比例脅迫處理隨著處理堿度的增加，SOD活性增強，如脅迫處理后24 h，A處理SOD活性顯著大于D處理，但鹽堿處理48 h后，A處理與D處理SOD活性差異不顯著，但顯著高于單鹽NaCl及對照處理。

鹽堿脅迫處理12 h內，POD活性與對照相比沒有顯著差異（圖8）。鹽堿脅迫處理12 h后，POD活性逐漸升高，24 h達到最高，顯著高于對照處理，隨著處理時間的延長，POD活性呈降低趨勢，鹽堿脅迫處理96 h后，單鹽NaCl、復雜鹽堿D組合、復雜鹽堿A組合處理POD酶活性顯著低于對照處理。

鹽堿脅迫處理后，包括對照在內的所有處理CAT活性隨著時間的延長均呈上升趨勢。但其相對酶活性（各處理酶活性與相同時間對照酶活性的比值）之間差異不顯著（圖9）。

圖6 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片丙二醛含量的影響Fig.6 Effect of saline－alkali stress on MDA of F.bidentis in leaves

圖7 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片超氧化物歧化酶活性的影響Fig.7 Effect of saline－alkali stress on SOD of F.bidentis in leaves

圖8 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片過氧化物酶的影響Fig.8 Effect of saline－alkali stress on POD of F.bidentis in leaves

圖9 鹽堿脅迫對黃頂菊葉片過氧化氫酶的影響Fig.9 Effect of saline－alkali stress on CAT of F.bidentis in leaves

3 討論

本實驗用天然鹽堿地普遍存在的4種致害鹽分按河北省鹽堿地的鹽分組成特點進行混合，模擬出24種可以代表河北省各種鹽堿地的脅迫條件處理黃頂菊種子。結果表明，鹽、堿脅迫對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響均表現為負相關。統(tǒng)計學分析結果表明在諸多脅迫因素中鹽度為主導因素，其對黃頂菊種子萌發(fā)和幼苗生長的影響明顯大于其他因素。

鹽脅迫是通過離子毒害及滲透脅迫來影響植物［26－28］。在種子萌動階段與環(huán)境的物質交流以吸水為主，所以，在黃頂菊種子萌動階段，以滲透脅迫為主。隨著鹽度脅迫的增強，黃頂菊種子周圍水勢下降，細胞內外水勢差也隨之變小，種子吸水困難，由于吸水不足，種子難以萌發(fā)。將未萌動的種子用蒸餾水沖洗干凈復萌后發(fā)現，黃頂菊種子仍能繼續(xù)萌發(fā)，而且未萌發(fā)種子的發(fā)芽率隨鹽濃度的增加而升高，其中以A300處理的恢復發(fā)芽率最高為57.36%，充分說明黃頂菊種子在低水勢情況下能保持種子活力，處于臨時休眠狀態(tài)，暫不萌發(fā)，到生長水勢適宜時再萌發(fā)、生長，完成生活周期。這很有可能是黃頂菊耐鹽堿的一種機制，也可能是黃頂菊對引入地適應性強的一種機制。

葉綠素是對鹽脅迫最敏感的細胞器，是重要的光合作用物質，葉綠素代謝是一個動態(tài)平衡過程，鹽堿脅迫下，植物細胞色素系統(tǒng)遭到破壞，導致葉綠素含量降低［29］。

正常生長條件下，植物體內活性氧的產生和清除之間保持著一種動態(tài)平衡，當植物遭受脅迫時，這種平衡就被破壞，首先影響的是生物膜。往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是膜脂過氧化作用的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。在鹽堿脅迫下，植物體內活性氧產生與清除的動態(tài)平衡被打破，造成活性氧的積累，而SOD、POD、CAT是植物體內活性氧清除系統(tǒng)中的3種重要抗氧化酶，能有效阻止活性氧在植物體內的積累。黃頂菊在遭受鹽堿脅迫時，雖然葉片細胞膜和葉綠素受到了不同程度的破壞，在鹽堿脅迫處理24 h內，各處理的丙二醛含量差異不顯著，推測在脅迫發(fā)生時，植物本身可以通過自身的機制加以調節(jié)，使其細胞膜的破壞降到最小，隨著脅迫時間的延長，細胞膜受到嚴重破壞，丙二醛的含量逐漸增加。其主要的原因可能是混合鹽堿脅迫下，雖然酶系統(tǒng)的功能加強，但其調節(jié)能力有限，因而體內還是積累了過剩的氧自由基，這些氧自由基又引起膜的過氧化，產生了大量的MDA，使MDA含量上升［30］。但是在脅迫初期黃頂菊葉片體內的SOD活性隨著堿濃度的提高而增加，24 h之后逐漸下降，96 h后其活性便低于對照處理。因為植物在遭受逆境脅迫時，產生的氧自由基數量增多，為了抵抗逆境對植物造成的傷害，超氧化物歧化酶的活性增加，以便清除氧自由基，減少膜脂過氧化，并隨著時間的推移逐漸消耗SOD，使其酶活性降低［31］。POD的活性鹽堿脅迫24 h內與對照相比顯著增加，隨后呈下降趨勢，72 h后又開始上升，但仍低于對照處理，在短期鹽堿脅迫時能及時清除葉片中積累的活性氧，暫時維持活性氧產生與清除的動態(tài)平衡，說明POD活性是逐漸適應環(huán)境而變化的［32］。由此推測，SOD和POD是清除鹽堿脅迫初期黃頂菊葉片中積累的活性氧的主要抗氧化酶。隨著脅迫時間的延長二者的活性逐漸降低，表明SOD和POD對鹽堿脅迫比較敏感，其酶結構極易遭受破壞。致使在脅迫處理后期黃頂菊葉片中的丙二醛逐漸累積。這有可能是黃頂菊耐鹽堿的另一種機制。

綜上所述，在鹽堿脅迫下黃頂菊體內氧自由基大量產生，導致丙二醛含量的升高，其抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD、POD協(xié)同作用，維持了植物體內活性氧的產生和清除之間的動態(tài)平衡。植物的抗逆反應是一個涉及到眾多基因，受多途徑調控的復雜過程，有關黃頂菊在鹽堿脅迫下SOD、POD活性誘導的分子機理尚需進一步深入研究。

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