信號(hào)分子H2O2調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)提高高羊茅耐熱性研究

王艷,李建龍,余醉,薛峰

(南京大學(xué)生命科學(xué)院,江蘇 南京210093)

高羊茅(Festuca arund inacea)是我國(guó)亞熱帶地區(qū)應(yīng)用最為廣泛的一種冷季型草坪草,然而,高溫脅迫仍然是其在該地區(qū)應(yīng)用的首要限制因子[1]。夏季高溫會(huì)造成草坪質(zhì)量下降,葉色枯黃,病、蟲、雜草危害加劇等各種問(wèn)題,因此冷季型草坪草耐熱性和抗熱調(diào)控機(jī)理的研究受到廣泛關(guān)注。當(dāng)熱脅迫發(fā)生時(shí),植物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡遭到破壞,過(guò)氧化氫(H2O2)被逐漸積累。H 2O2能與植物體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂類發(fā)生反應(yīng),造成氧化傷害和細(xì)胞代謝失調(diào)[2]。但是,植物體內(nèi)存在抗氧化酶和抗氧化劑,可以形成復(fù)雜而有效的應(yīng)激機(jī)制,阻止或者延緩氧化傷害的發(fā)生。過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物中最常見的抗氧化酶,抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)也是植物體內(nèi)清除H2O2的重要抗氧化系統(tǒng),它由抗氧化劑,抗壞血酸和谷胱甘肽,以及抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)等抗氧化酶共同組成。逆境脅迫下AsA和GSH的含量越高,或者各種抗氧化酶的活性越高,則物種的抗逆性越強(qiáng),這已經(jīng)在許多植物中都被證明[1-4]。

然而,最近的研究認(rèn)為脅迫初期由于抗氧化系統(tǒng)的存在和激活,低濃度活性氧不但不會(huì)造成氧化傷害,還有可能起到傳遞壓力信號(hào)的作用,只有當(dāng)其積累量超出了清除系統(tǒng)的清除能力時(shí),氧化傷害才會(huì)形成[5]。H 2O2在植物細(xì)胞中存在時(shí)間長(zhǎng);可以在細(xì)胞間跨膜長(zhǎng)距離傳遞;能夠快速生成并響應(yīng)于各種環(huán)境脅迫,這些都是細(xì)胞中信號(hào)分子的重要特征,因此,H2O2作為信號(hào)分子的生理功能在最近幾年引起廣泛的關(guān)注[5]。H2O2在環(huán)境脅迫防御反應(yīng)中的信號(hào)作用也得到證實(shí),H 2O2預(yù)處理可以提高玉米(Zeamays)幼苗的耐寒性[6];大麥(Hordeum vulgare)種子經(jīng)過(guò)H2 O2處理后提高了其幼苗的耐鹽性[7],并且抗性的獲得與抗氧化酶活性提高以及GSH含量變化相關(guān)。

逆境條件下植物首先需要感受逆境信號(hào),并在細(xì)胞內(nèi)傳遞這些信號(hào),使植物得以對(duì)不良環(huán)境做出響應(yīng),進(jìn)而通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)提高植物的耐受性和抗性。對(duì)逆境信號(hào)的生理功能研究不僅可以揭示植物抗逆性機(jī)理,而且對(duì)推動(dòng)草坪植物的分子遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究也非常重要。然而有關(guān)草坪草信號(hào)分子的研究還很少,因此,本研究探討了低濃度H 2O2預(yù)處理對(duì)高羊茅葉片中抗氧化系統(tǒng)的信號(hào)調(diào)控作用及與其耐熱性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料為凌志高羊茅(F.arundinacea cv.Barlexas),草坪草種子購(gòu)自北京克勞沃種子公司。2008年4月初選擇健康的草坪草種子播種在裝有混合培養(yǎng)基質(zhì)(沙子∶蛭石∶有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土=3∶1∶1)的聚乙烯花盆中。所有盆缽在室外自然光照下進(jìn)行培養(yǎng),氣溫為15～26℃。每周用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次,每天澆水。30 d后將所有盆缽轉(zhuǎn)移到人工氣候箱培養(yǎng)14 d,管理方式同上,人工氣候箱被設(shè)置為14 h的光周期,光照強(qiáng)度為400 μmol/(m2·s),相對(duì)濕度為(65±10)%,溫度為26/15℃(晝/夜,對(duì)照溫度)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照(CK)和H 2O2預(yù)處理(HT),預(yù)處理植株用10mmol/L的H2O2水溶液(預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳濃度),對(duì)照用等量的蒸餾水,均完全噴濕葉片。預(yù)處理植株先在正常生長(zhǎng)溫度(15/26℃,晝/夜)下培養(yǎng)12 h使H 2O2被高羊茅葉片充分吸收,然后將對(duì)照和處理植株都轉(zhuǎn)入38/30℃(晝/夜,處理溫度)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫,光照、相對(duì)濕度以及管理方式同上。分別在脅迫第0,3和6天取不同處理和對(duì)照的高羊茅葉片測(cè)定POD、CAT、APX、GR、GPX和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性、AsA、氧化型抗壞血酸(DHA)、GSH 和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,以及脅迫過(guò)程中的丙二醛(MDA)和H2O2水平。

1.2 測(cè)試指標(biāo)

1.2.1 MDA含量的測(cè)定 根據(jù)硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[8]。

1.2.2 H2O2含量的測(cè)定 根據(jù)Dagmar等[9]的方法。

1.2.3 抗氧化劑AsA、DHA、GSH和GSSG含量的測(cè)定 取樣品材料0.2 g,用5 m L預(yù)冷的磺基水楊酸(5%)在冰浴中碾磨混勻,然后在4℃,10 000 r/min下低溫離心20 min分離勻漿,上清液根據(jù)李忠光等[10]的方法用以測(cè)定A sA、DHA、GSH 和GSSG的含量。

1.2.4 抗氧化酶的提取和活性測(cè)定 樣品在5m L預(yù)冷的0.05mmol/L磷酸鉀緩沖液[pH值7.6,內(nèi)含2%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.5mmol/L AsA]中冰浴研磨。勻漿于10 000 r/min,4℃離心20min,上清液即為酶粗提液,用于測(cè)定各種抗氧化酶的活性。POD、CAT、APX活性測(cè)定根據(jù)Larkindale和H uang[2]的方法。GR活性測(cè)定根據(jù)Smith等[11]的方法。GPX和GST使用由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(4個(gè)重復(fù))。所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,實(shí)驗(yàn)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)高羊茅高溫脅迫下MDA和過(guò)氧化氫含量的影響

在脅迫的0和3 d,高羊茅葉片中的MDA含量變化不顯著(P>0.05)(圖1A),表明在脅迫的前3 d植株體內(nèi)的自我防御系統(tǒng)足以保護(hù)植物免受傷害。而在脅迫第6天,處理和對(duì)照植株中的MDA含量都顯著升高(P<0.05),并且處理葉片中的MDA含量顯著低于對(duì)照(P<0.05)。脅迫前(0 d)預(yù)處理高羊茅葉片中的H2 O2濃度顯著高于對(duì)照(P<0.05)。這可能是由于噴施外源H2O2在葉片中的殘留,也可能是外源H2O2誘發(fā)的內(nèi)源H2O2的升高。在脅迫第3天略低于對(duì)照,第6天對(duì)照和處理葉片中的H2O2濃度都被顯著增加,但是處理中H 2O2濃度顯著低于對(duì)照(P<0.05)(圖1B)。與MDA的變化趨勢(shì)一致,表明此時(shí)高溫脅迫引起的氧化傷害已經(jīng)形成。但是,噴施低濃度的H2O2減輕了草坪草葉片的氧化傷害。

2.2 H2O2對(duì)高羊茅高溫脅迫下抗氧化劑含量的影響

AsA是一種重要的抗氧化劑,不但可以作為APX的底物,還可以直接和H2O2進(jìn)行反應(yīng),使H2O2還原為H2O,同時(shí)A sA被氧化為DHA。在本實(shí)驗(yàn)中高羊茅對(duì)照和處理葉片中的AsA含量在高溫脅迫第3天和第6天差異均不顯著(P>0.05)(表1),但都顯著高于脅迫前(0 d),表明熱脅迫本身升高了AsA的含量。脅迫前處理和對(duì)照中的AsA含量差異不顯著,可能意味著它在本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有直接受到外源H2O2的影響,而是通過(guò)APX參與了抗氧化反應(yīng)。高羊茅對(duì)照與處理葉片中的DHA含量在脅迫過(guò)程中變化均不顯著?？偪箟难岬暮吭诟哐蛎?duì)照和處理葉片中都呈上升趨勢(shì),但增加不顯著。受AsA、DHA和總抗壞血酸的含量不顯著變化的影響,AsA/總抗壞血酸含量和AsA/DHA在高溫脅迫前后都沒(méi)有發(fā)生顯著變化(P>0.05)。表明在6 d的熱脅迫過(guò)程中DHA可以得到及時(shí)的還原,A sA的氧化還原狀態(tài)保持動(dòng)態(tài)平衡。

圖1 外施低濃度H 2O2對(duì)高溫脅迫下高羊茅葉片中MDA和H2O 2含量的影響Fig.1 Ef fects of p re-treatmentswith H 2O2 on MDA and H2 O2 content in F.arundinacea leaves during heatstress(38/30℃,day/night)

表1 高溫脅迫下外施低濃度H 2O 2對(duì)高羊茅葉片中抗壞血酸相關(guān)參數(shù)的影響Table 1 Effects of pre-treatmentswith H2 O2 on parameters related to AsA in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night)

不管是對(duì)照還是處理葉片中的GSH在高溫脅迫第3天和第6天與脅迫前相比顯著降低(P<0.05)(表2)。而對(duì)照和處理葉片中的GSSG在高溫脅迫時(shí)相比脅迫前(0 d)都顯著升高(P<0.05),但是脅迫第3天和第6天的GSSG差異不顯著(P>0.05)。表明脅迫直接影響了谷胱甘肽的氧化和還原狀態(tài)。脅迫過(guò)程中總谷胱甘肽含量在對(duì)照中變化不顯著,而在處理葉片中變化顯著。H2O2預(yù)處理在脅迫前顯著提高了高羊茅葉片中的GSH含量(P<0.05),在脅迫第3天預(yù)處理中的GSH含量高于對(duì)照,差異不顯著(P>0.05),但第6天顯著低于對(duì)照(P<0.05)。處理植株中的GSH/總谷胱甘肽和GSH/GSSG在高溫脅迫前低于對(duì)照,并且隨著脅迫的進(jìn)行逐漸降低。表明H 2O2預(yù)處理使GSH含量的升高,參與了隨后熱脅迫過(guò)程中的抗氧化反應(yīng),對(duì)高羊茅葉片細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.3 H2O2對(duì)高溫脅迫下高羊茅抗氧化酶活性的影響

高溫脅迫前(0 d)和脅迫過(guò)程中(第3天和第6天),H2O2預(yù)處理不顯著地提高了高羊茅葉片中的POD和CAT活性(P>0.05)(表3)。表明外源H2O2可以在脅迫前增加CAT和POD的活性以抵御隨后因高溫而引起的氧化傷害。但是對(duì)照和處理葉片中的POD活性隨脅迫的進(jìn)行呈增加趨勢(shì),表明熱脅迫本身誘導(dǎo)了POD的活性升高。而對(duì)照和處理葉片中的CAT活性都隨脅迫的延長(zhǎng)而逐漸降低,在高羊茅抵御熱脅迫的過(guò)程中,CAT可能不是主要的抗氧酶。H2O2預(yù)處理在整個(gè)脅迫過(guò)程中都提高了高羊茅葉片中的APX活性,在脅迫前預(yù)處理中的APX活性比對(duì)照升高了50%,并且在脅迫第3天對(duì)照和處理中的APX達(dá)到峰值,顯著高于脅迫前的水平(P<0.05)。GR的作用是將GSSG還原為GSH,與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)即GSH/GSSG直接相關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)處理葉片GR在脅迫第3天和第6天顯著高于對(duì)照40%左右,脅迫前(0 d)不顯著高于對(duì)照。表明APX和GR對(duì)于高羊茅抗熱性的獲得具有重要作用。植物還可以以GSH為底物,通過(guò)依賴于GSH的保護(hù)酶GST和GPX直接參與膜脂過(guò)氧化的解毒過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2預(yù)處理在熱脅迫過(guò)程中顯著提高了高羊茅葉片中的GPX活性,在0,3和6 d分別高于對(duì)照38%,116%和93%。但是,幾乎沒(méi)有改變GST的活性?？梢奌 2O2可以直接激活GPX,而對(duì)GST的無(wú)顯著誘導(dǎo)作用,GPX可能是高羊茅抗熱過(guò)程中一種重要的保護(hù)酶。

表2 高溫脅迫下外施低濃度H2O2對(duì)高羊茅葉片中GSH相關(guān)參數(shù)的影響Table 2 Effects of pre-treatmentswith H2O2 on parameters related to GSH in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night)

表3 高溫脅迫下低濃度H2O2預(yù)處理對(duì)高羊茅葉片中抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of pre-treatmentswith H2O2 on antioxdativeenzymes activity in F.arundinacea leaves during heat stress(38/30℃,day/night) U/(mg蛋白Protein·m in)

3 討論

高溫是制約冷季型草坪草生長(zhǎng)、發(fā)育和影響草坪質(zhì)量最重要的生態(tài)因子之一。高溫會(huì)導(dǎo)致植物光合作用的下降,細(xì)胞膜的破壞,甚至整個(gè)植株的衰老和死亡。當(dāng)脅迫發(fā)生時(shí),胞外信號(hào)首先被植物質(zhì)膜上的受體識(shí)別并結(jié)合,信號(hào)傳遞通路得以激活,胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào),再由胞內(nèi)信使調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生理生化反應(yīng)。胞內(nèi)信使很少,往往是通用的。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)低濃度的H 2O2可以直接誘導(dǎo)大量防御基因的表達(dá)和相關(guān)酶活性的升高,抵御脅迫傷害的發(fā)生[6,7,12]。因此,越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)同脅迫初期低濃度的H2 O2可能起到脅迫信號(hào)的作用參與植物的防衛(wèi)反應(yīng),而隨著脅迫的進(jìn)行,當(dāng)H2O2的積累水平超過(guò)植株的清除水平時(shí)氧化傷害才發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)脅迫前(0 d)高羊茅預(yù)處理葉片中H2O2含量升高,但是MDA含量未變化,表明此時(shí)H2O2沒(méi)有對(duì)植物造成的氧化傷害。葉片中H2 O2含量的升高可能來(lái)自于外源H 2O2噴施的殘留,也可能因?yàn)橥庠碒2 O2誘發(fā)了內(nèi)源H 2O2的升高。到脅迫第6天,處理和對(duì)照植株葉片中MDA和H 2O2含量都顯著升高,但處理仍然低于對(duì)照。表明此時(shí)高溫脅迫引起的氧化傷害已經(jīng)形成,但是噴施H2 O2推遲了草坪草處理植株中氧化傷害的發(fā)生。

脅迫條件下,植物體內(nèi)H 2O2的平衡與抗氧化酶的活性和抗氧化劑的含量密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)H 2O2預(yù)處理在脅迫發(fā)生前(0 d)預(yù)先提高了高羊茅葉片中的POD、CAT、APX、GR和GPX的活性,表明低濃度的H2 O2可能起到一個(gè)中度脅迫的作用,代替植物的熱鍛煉過(guò)程誘導(dǎo)了植株的抗氧化系統(tǒng),從而抑制了隨后發(fā)生的脅迫傷害[13]。在以后的脅迫過(guò)程中,POD活性隨著脅迫時(shí)間的增加而增加,它以酚類化合物為底物催化H2O2還原,而過(guò)氧化物酶參與了細(xì)胞分泌的酚聚合物形成木質(zhì)素的過(guò)程,因此推測(cè)熱脅迫中POD活性增加可能促進(jìn)了草坪草的木質(zhì)化過(guò)程,增加草坪草細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度,更有利于保持細(xì)胞的穩(wěn)定[14]。CAT可以直接催化H2O2的還原,然而在本研究中CAT活性隨熱脅迫的進(jìn)行逐漸降低,表明熱脅迫本身可能抑制了高羊茅葉片中的CAT活性。APX以AsA為底物催化H2O2還原為H 2O,啟動(dòng)AsA-GSH循環(huán),脅迫前和脅迫過(guò)程中處理葉片的APX活性顯著高于對(duì)照,表明APX在高羊茅抗熱性的獲得中起重要作用[15]。另外AsA也可以直接和H 2O2反應(yīng)將其還原,同時(shí)AsA被氧化為DHA。不過(guò)在本實(shí)驗(yàn)中A sA的氧化型和還原型在6 d的熱脅迫過(guò)程中基本保持了動(dòng)態(tài)平衡,DHA及時(shí)得到還原。AsA更可能是通過(guò)APX參與了抗氧化反應(yīng)。DHA可以以GSH為底物通過(guò)脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)被還原為AsA,在這個(gè)過(guò)程中引起GSH從還原型向氧化型(GSSG)的轉(zhuǎn)變。而GR的作用是以NADPH為底物將GSSG還原為GSH,從而使A sA和GSH得以在AsA-GSH循環(huán)中循環(huán),調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。GR活性是這個(gè)循環(huán)的限制步驟[16]。對(duì)照和處理葉片中的GR活性一直高于對(duì)照,并且隨著熱脅迫地進(jìn)行而升高,可見GR在高羊茅防御熱脅迫過(guò)程中起到重要作用。

已有研究表明低溫可以直接通過(guò)H 2O2濃度的改變和GSH/GSSG的改變激活細(xì)胞中的氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)途徑[17]。本研究也得到同樣的結(jié)論,H 2O2預(yù)處理在脅迫前直接改變了GSH/GSSG,并且這一比值隨著脅迫的進(jìn)行而降低,但是谷胱甘肽的總含量沒(méi)有發(fā)生顯著變化。GSH還可以通過(guò)2種依賴于GSH的保護(hù)酶GST和GPX直接參與膜脂過(guò)氧化的解毒過(guò)程[16]。GPX是動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要H2O2清除劑,但是現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)在植物中GPX也具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害的作用[18]。GST能催化還原型谷胱甘肽的巰基與多種親電、親脂底物的結(jié)合,生成水溶性的產(chǎn)物,從而降低底物的毒性,使膜免遭氧化傷害,它還具有過(guò)氧化物酶活性,能解除羥基過(guò)氧化物的毒性[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2 O2預(yù)處理在熱脅迫過(guò)程中顯著升高了高羊茅葉片中的GPX活性,而對(duì)GST活性沒(méi)有影響?？梢奊PX是高羊茅體內(nèi)清除氧化傷害的重要抗氧化酶之一,而GST對(duì)于高羊茅抵御高溫脅迫無(wú)顯著作用。綜上所述,低濃度的H 2O2具有傳遞脅迫的信號(hào)分子作用,在脅迫發(fā)生前激活了高羊茅體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),即提高抗氧化酶活性和改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)(GSH/GSSG),從而減緩了隨后發(fā)生的熱脅迫對(duì)高羊茅的氧化傷害,提高了其抗熱性。

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