阿托伐他汀通過(guò)抑制ERK/MAPK信號(hào)通路改善H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

解小萌，崔麗杰，劉海濤

高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。作為組織和血液間的屏障，血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成及創(chuàng)傷修復(fù)等過(guò)程中起著重要作用，研究已證實(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙與高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化有密切關(guān)系[2]。因此，尋找能夠保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的方法，對(duì)心血管疾病的預(yù)防及治療具有重要意義。阿托伐他汀是常用的血脂調(diào)節(jié)藥物，具有降低血脂含量，減少動(dòng)脈斑塊發(fā)生以及改善血管內(nèi)皮、抑制血管炎癥反應(yīng)的作用[3]。目前，雖已證實(shí)阿托伐他汀對(duì)改善血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)具有積極影響[4]，但其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制研究依然很少。Xu等[5]研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要病理因素。本研究利用H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化應(yīng)激損傷[6]建立細(xì)胞損傷模型，探討阿托伐他汀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制，以期為心血管疾病的機(jī)制研究及臨床治療提供新的可行性方案。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和受試藥物人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。阿托伐他汀由美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，使用前將4.2 mg阿托伐他汀藥物溶于0.1 ml的95%乙醇中，滴加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至7.2，50℃水浴中孵育2 h，得到濃度為1 mol/L的阿托伐他汀溶液，-20℃保存以待使用。

1.2 主要試劑及儀器ɑ-MEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；四甲基偶氮鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；H2O2溶液購(gòu)自北京生物技術(shù)公司，4℃避光保存。乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；免疫印跡一抗p-ERK1/2、ERK1/2、p38MAPK、p-p38 MAPK購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；全功能熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組HUVECs細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素雙抗的ɑ-MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（100 μmol/L H2O2處理）、阿托伐他汀組（10 μmol/L阿托伐他汀+100 μmol/L H2O2）、U0126組（100 μmol/L ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126+100 μmol/L H2O2）、阿托伐他汀+LM22B-10組（10 μmol/L阿托伐他汀和100 μmol/L ERK/MAPK信號(hào)通路激活劑LM22B-10+100 μmol/L H2O2）。待細(xì)胞密度約為80%時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)2 h，阿托伐他汀組、U0126組、阿托伐他汀+LM22B-10組分別用相應(yīng)藥物處理6 h，100 μmol/L H2O2處理18 h。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)細(xì)胞分組處理后，每孔加入MTT 20 μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清液后，每孔加入二甲亞砜200 μl，振蕩10 min，放入酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A空白組×100% 。在研究前需要研究阿托伐他汀的細(xì)胞毒性，用不同濃度的阿托伐他?。?.01、0.1、1、10、100 μmol/L）處理細(xì)胞6 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.3.3 吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）核染色用AO/EB染色法觀察了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。將細(xì)胞以密度為3×104/cm2的細(xì)胞接種在6孔板上，處理方式同1.3.1。加入5 μl AO/EB（g/ml）。在室溫下培養(yǎng)10 min后，用熒光顯微鏡（Ix71型，日本奧林巴斯公司）觀察。隨機(jī)觀察至少300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量檢測(cè)收集各組細(xì)胞并離心（室溫，3000 r/min離心5 min）。超聲破碎細(xì)胞后獲得勻漿，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量。

1.3.5 ROS含量檢測(cè)用2 μl 2’-7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，收集各組細(xì)胞，置于無(wú)胎牛血清的ɑ-MEM培養(yǎng)基中，加入2 μl DCFH-DA，最終濃度為20 mmol/L，室溫下孵育30 min。隨后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

1.3.6 ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)收集細(xì)胞并用RIPA裂解液（4%十二烷基磺酸鈉+2 mmol/L EDTA+50 mmol/L Tris-HCl，pH6.8）裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Bradford法定量蛋白濃度。各組取40 μg蛋白樣本進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用生理鹽水/1% Tween-X緩沖液加5%脫脂奶粉在室溫下培養(yǎng)1 h，阻斷非特異性結(jié)合。用ERK1/2、p-ERK1/2抗體、p38 MAPK、p-p38 MAPK（1:1000）在4℃培養(yǎng)過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗小鼠二抗（1:5000）室溫培養(yǎng)2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，并用GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，隨后進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀細(xì)胞毒作用不同濃度阿托伐他?。?.01、0.1、1、10、100 μmol/L）作用于HUVECs 6 h后，細(xì)胞存活率分別為（99.47±2.69）%、（101.15±3.13）%、（97.56±2.35）%、（97.30±3.38）%、（92.45±3.45）%，均不低于90%，說(shuō)明當(dāng)濃度≤100 μmol/L時(shí)，阿托伐他汀對(duì)HUVECs均無(wú)明顯毒性?？紤]到阿托伐他汀100 μmol/L時(shí)，HUVECs存活率有降低趨勢(shì)，我們選取10 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)用濃度（圖1A）。

2.2 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率為（67.42±3.39）%，較空白對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；而阿托伐他汀組（85.40±5.51）%和U0126組（78.14±3.75）%細(xì)胞存活率均低于空白對(duì)照組，但均高于模型組（P＜0.05）；此外，阿托伐他汀+LM22B-10組細(xì)胞存活率（72.68±2.84）%同樣高于模型組，但是低于空白對(duì)照組和阿托伐他汀組（P＜0.05），圖1B。

圖1 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)AO/EB染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著增加[（39.26±5.35）% vs.（4.48±2.20）%，P＜0.05]；阿托伐他汀組（18.75±2.70）%和U0126組（23.82±3.30）%細(xì)胞凋亡率均較空白對(duì)照組高，但均較模型組低（P＜0.05）；此外，阿托伐他汀+LM22B-10組細(xì)胞凋亡率（32.76±4.48）%亦較模型組低，但高于空白對(duì)照組、阿托伐他汀組和U0126組（P＜0.05），圖2。

圖2 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響（×400）

2.4 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中LDH、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低（P＜0.05）；阿托伐他汀組和U0126組細(xì)胞中LDH、MDA含量較空白對(duì)照組高而較模型組低，SOD、GSH-Px含量較空白對(duì)照組低而較模型組升高（P＜0.05）；此外，阿托伐他汀+LM22B-10組細(xì)胞中LDH、MDA含量較模型組降低而較空白對(duì)照組和阿托伐他汀組高，同時(shí)SOD、GSH-Px含量較模型組高而較空白對(duì)照組、阿托伐他汀組和U0126組降低（P＜0.05），表1。

表1 阿托伐他汀對(duì)HUVECs細(xì)胞中LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

2.4 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的影響細(xì)胞內(nèi)ROS含量由細(xì)胞滲透性DCFH-DA光源的熒光2’,7’-二氯熒光素（7'-Dichlorofluorescein，DCF）確定。模型組的DCF熒光強(qiáng)度為5876.59±768.45，顯著高于空白對(duì)照組（386.23±52.64）（P＜0.05）；阿托伐他汀組和U0126組細(xì)胞的ROS含量（DCF熒光強(qiáng)度分別為1870.43±236.20和2898.86±542.44）較空白對(duì)照組高但較模型組低（P＜0.05）；此外，阿托伐他汀+LM22B-10組細(xì)胞ROS含量（DCF熒光強(qiáng)度：4096.58±435.22）較模型組低，但較空白對(duì)照組、阿托伐他汀組和U0126組高（P＜0.05），圖3。

圖3 阿托伐他汀對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的影響（×100）

2.5 阿托伐他汀對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路的影響與空白對(duì)照組比較，模型組中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表達(dá)比值上調(diào)；阿托伐他汀組和U0126組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表達(dá)比值高于空白對(duì)照組，但較模型組降低（P＜0.05）；此外，阿托伐他汀+LM22B-10組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表達(dá)比值則高于空白對(duì)照組、阿托伐他汀組和U0126組（P＜0.05），表2及圖4。

圖4 阿托伐他汀對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值差異

3 討論

近年來(lái)，隨著生活習(xí)慣及飲食文化的改變，心血管疾病的發(fā)病率急劇上升且呈年輕化趨勢(shì)，研究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新的心血管保護(hù)措施，對(duì)心血管疾病的預(yù)防與控制具有重大意義。農(nóng)毅清等[2]研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能的改變?cè)谛难芗膊“l(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。由于氧化應(yīng)激可使細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而使蛋白質(zhì)和核酸變性，因而被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要病理因素[7]。本研究以H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞氧化損傷為模型，探討阿托伐他汀對(duì)氧化損傷HUVECs細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響，進(jìn)一步探討了其可能的分子機(jī)制。

之前的研究表明，氧化應(yīng)激在激活細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的調(diào)控中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用[8]。ROS是生物有氧代謝的產(chǎn)物，ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用，ROS的形成總是伴隨著抗氧化酶系統(tǒng)的上調(diào)，如SOD[9]和GSH-Px[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著下降，ROS含量和LDH漏出明顯增多，細(xì)胞凋亡率明顯增加，SOD和GSH-Px含量則顯著下降。這些結(jié)果表明H2O2能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力，引發(fā)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。而經(jīng)阿托伐他汀處理后，H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞死亡和凋亡率均顯著降低，增殖活性亦顯著高于H2O2模型組，同時(shí)細(xì)胞中MDA的含量以及ROS釋放量均降低，而SOD和GSH-Px的含量則升高，說(shuō)明阿托伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡明顯降低H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）能夠調(diào)控包括細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡及應(yīng)激凋亡等在內(nèi)的多種生理過(guò)程[11]。其中，磷酸化的ERK1/2、p38 MAPK由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，可調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)、酶和轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而參與細(xì)胞對(duì)外部刺激的生物反應(yīng)[12,13]。越來(lái)越多研究表明，ERK1/2、p38 MAPK是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14]。本研究中，H2O2誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而促使血管內(nèi)皮功能障礙，同時(shí)伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，模型組中p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表達(dá)比值上調(diào)，而阿托伐他汀組p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表達(dá)比值則較模型組顯著下調(diào)。說(shuō)明阿托伐他汀通過(guò)抑制ERK1/2、p38 MAPK磷酸化激活，進(jìn)而抑制ROS過(guò)度產(chǎn)生引起的HUVECs細(xì)胞凋亡，從而減輕H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證阿托伐他汀是否通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，在實(shí)驗(yàn)中使用了ERK/MAPK抑制劑U0126及阿托伐他汀與ERK/MAPK激活劑LM22B-10組合。結(jié)果表明，用U0126處理后，H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為受到抑制，ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化水平明顯降低。ERK/MAPK激活劑LM22B-10的處理則能夠逆轉(zhuǎn)該趨勢(shì)。以上數(shù)據(jù)提示，阻斷ROS/ERK/MAPK信號(hào)通路可能是阿托伐他汀在H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮保護(hù)作用的原因。

綜上所述，阿托伐他汀通過(guò)抑制ERK/MAPK信號(hào)通路改善H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，該研究為阿托伐他汀在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的證據(jù)支持。