乳增寧膏對(duì)乳腺增生病模型大鼠內(nèi)分泌激素及免疫功能的影響

曹 暉 劉麗芳* 祁 林

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)外科（410007）

乳腺增生癥的發(fā)病原因尚不十分清楚。一般認(rèn)為與卵巢內(nèi)分泌功能紊亂有關(guān)。黃體素分泌不足，雌激素相對(duì)或絕對(duì)過(guò)多，以致月經(jīng)周期中乳腺組織增生和復(fù)舊過(guò)程發(fā)生紊亂，使乳腺導(dǎo)管或腺泡上皮增生，乳管擴(kuò)張成囊狀，形成腫塊。目前，西醫(yī)常采用雌激素類藥物及碘制劑等療法，效果不甚理想且不良反應(yīng)較大，外科手術(shù)治療又常引起其他部位的復(fù)發(fā)，且患者較難接受。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)外科劉麗芳教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，制成乳增寧膏治療本病，臨床療效顯著，本研究對(duì)乳增寧膏外治乳腺增生病進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)乳腺增生大鼠內(nèi)分泌激素及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)的影響，以期探討乳增寧膏治療乳腺增生病的作用機(jī)制，為中醫(yī)外治本病提供可靠的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一級(jí)SD雌性未孕大鼠，體治療（226±16）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字第20-011號(hào)。于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室溫23～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 儀器與試藥

日本產(chǎn)CL-7200自動(dòng)生化分析儀，GL-1200Y放射免疫計(jì)數(shù)器，B超（日本ALORasso-620型），ACUSAN128XP/10彩超（USA產(chǎn)）。苯甲酸雌二醇、黃體酮（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)分別為H20070536、H200705545）；乳增寧膏由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，藥物組成：九香蟲、丁香、延胡索、皂角刺、王不留行、乳香、沒(méi)藥、海藻、昆布、鹿角膠、仙靈脾、橘核、白附子、木鱉子、麝香。藥物制備：除麝香外所有藥物研末，過(guò)100目篩，麝香另置，加入氮酮促皮吸收劑，攪勻制成膏料，加入載體聚脂，貼膏，再用層壓的方法將膏藥與保護(hù)層（聚乙烯薄膜）復(fù)合乳增寧膏劑備用。

1.3 動(dòng)物造模及分組

參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行造模。對(duì)大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，并每天肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，1次/d，連續(xù)20d，繼而改用黃體酮5mg/kg，1次/d，連續(xù)5d。造模成功。

60只大鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組10只，乳腺增生模型組10只，乳增寧膏低、高劑量組各10只，乳癖消灌胃組10只，乳癖消外敷組10只。待造模成功后，乳增寧膏高、低劑量組每天進(jìn)行乳增寧膏外貼，選取造模后大鼠最腫大的第二對(duì)乳房用藥物外貼，每3d換藥1次，連續(xù)60d。乳增寧膏低劑量組0.12g（6g/kg），高劑量組0.24g（12g/kg），覆蓋面積均為3cm2。乳癖消外敷組：乳癖消片研磨成細(xì)粉0.8g/kg，方法與療程同上。于實(shí)驗(yàn)第61天處死動(dòng)物，取頸動(dòng)脈血檢測(cè)血清內(nèi)分泌激素、T細(xì)胞等；取乳腺組織觀察ER、PR；HE染色，光鏡下觀察導(dǎo)管上皮層數(shù)、小葉腺泡數(shù)目。

1.3 觀察指標(biāo)

①血清內(nèi)分泌激素測(cè)定，放免法測(cè)血清中孕酮（P）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、垂體促乳素（PRL）（測(cè)定試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所生產(chǎn)）。②用免疫組織化學(xué)法測(cè)定雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR），光鏡觀察導(dǎo)管上皮數(shù)，小葉腺泡數(shù)。③間接熒光免疫法測(cè)T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8，計(jì)算CD4/CD8的比值的表達(dá)和變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0軟件中，采用方差分析，各組間比較用q檢驗(yàn)，α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)血清內(nèi)分泌激素的影響

模型組與正常組孕酮（P）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、垂體促乳素（PRL）指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。乳增寧高、低劑量組，乳癖消外敷組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示3組藥物均可提高血清P、E2、PRL的水平（P＜0.05），降低T的水平，以乳增寧高劑量組作用最為顯著（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)乳腺增生大鼠導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)的影響

模型組與正常組比較，導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)明顯增多（P＜0.05）。與模型組比較，其余3組大鼠的乳腺增生程度均有不同程度的改善。乳增寧高、低劑量組，乳癖消外敷組與模型組比較，增生程度均低于模型組，導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3組間導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 各組孕酮、睪酮、T、E2、PRL指標(biāo)比較（±s，pg/mL）

表1 各組孕酮、睪酮、T、E2、PRL指標(biāo)比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，cP＜0.05，與模型組比較，aP＜0.05，與乳增寧高劑量組比較，bP＜0.05

組 別 n P T E2 PRL正常組 10 12.1±5.4 18.2±4.9 99.4±56.2 6.11±0.27模型組 10 15.2±10.7c 16.8±7.8c 681.6±78.2c 8.43±0.31c乳增寧膏低劑量組 10 18.7±7.4ab 9.9±4.2ab 781.3±122.3ab 7.23±0.33a乳增寧高膏劑量組 10 29.1±9.1a 7.1±5.3a 834.0±87.6a 7.11±0.46a乳癖消外敷組 10 19.3±6.9ab 10.1±3.9ab 786.6±99.3ab 7.13±0.36a

表2 乳增寧膏對(duì)乳腺增生大鼠導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)的影響（±s）

表2 乳增寧膏對(duì)乳腺增生大鼠導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)的影響（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05，與模型組比較，bP＜0.05

組 別 n 導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù) 腺泡數(shù)正常組 10 3.27±0.87 4.41±0.57模型組 10 7.81±0.91a 16.12±1.68a乳增寧膏低劑量組 10 2.45±0.68b 7.23±0.33b乳增寧膏高劑量組 10 2.77±0.78b 7.11±0.46b乳癖消外敷組 10 2.61±0.57b 6.89±0.4b

2.3 對(duì)ER、PR表達(dá)的影響

ER、PR陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞核著色時(shí)為陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞率取積分，計(jì)算各組ER、PR積分，具體參照文獻(xiàn)[2]擬定。分值愈高表明ER、PR含量愈高。結(jié)果提示乳增寧高、低劑量組能降低乳腺病理組織ER、PR積分，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01），提示乳增寧能減少乳腺組織ER、PR的含量。其作用主要是通過(guò)減少ER和PR的數(shù)量，減少E對(duì)受體的感受性，抑制乳腺組織的增生，見(jiàn)表3。

表3 對(duì)乳腺增生大鼠ER和PR的影響（±s）

表3 對(duì)乳腺增生大鼠ER和PR的影響（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05，與模型組比較，bP＜0.05。與與乳增寧高劑量組比較，cP＜0.05

組 別 n PR積分 ER積分正常組 10 2.49±0.27 2.43±0.32模型組 10 4.71±0.61a 4.61±0.61a乳增寧膏低劑量組 10 2.56±0.43bc 2.64±0.49bc乳增寧膏高劑量組 10 2.81±0.51b 2.85±0.56b乳癖消外敷組 10 2.31±0.48bc 2.21±0.38bc

2.4 對(duì)乳腺增生患者免疫功能的影響

本組主要對(duì)乳增寧高、低劑量組與正常組免疫指標(biāo)變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果提示：與正常組比較，乳增寧高劑量組對(duì)各個(gè)免疫指標(biāo)有較為明顯的提高作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 對(duì)乳腺增生患者免疫功能的影響（±s）

表4 對(duì)乳腺增生患者免疫功能的影響（±s）

注：與治療前比較，aP＜0.05

免疫指標(biāo) 正常組 乳增寧膏低 乳增寧膏高(n=10) 劑量組(n=10) 劑量組(n=10)CD3(%) 68.93±5.44 70.10±3.98 74.21±4.98a CD4(%) 40.78±4.29 41.02±3.49 44.16±4.25a CD8(%) 29.43±4.34 30.26±3.63 33.22±2.98a CD4/CD8 1.51±0.33 1.57±0.29 1.67±0.58a

3 討 論

乳腺增生病是乳房的一種非炎癥性疾病，又稱乳腺小葉增生、慢性囊性乳腺病。多見(jiàn)于25～40歲的婦女。乳房脹痛和乳房?jī)?nèi)出現(xiàn)腫塊為主要臨床表現(xiàn)。近年來(lái)研究表明，乳腺癌的發(fā)生與乳腺增生病有一定的關(guān)系，乳腺上皮細(xì)胞非典型增生是重要的癌前病變，流行病學(xué)顯示，非典型增生癌變危險(xiǎn)性比正常人群增加到5倍[3]。乳腺的增生存在內(nèi)分泌失調(diào)，主要是P、T分泌不足，PRL異常升高以及E2、P平衡失調(diào)，進(jìn)而影響乳腺組織正常平衡性變化，雌激素的過(guò)度刺激使乳腺組織從正常到增生乃至腫瘤形成[4]。而T淋巴活性細(xì)胞是雌激素作用的主要靶器官，內(nèi)分泌激素尤其是E2、P、T與免疫功能更為密切，有研究顯示，乳腺增生病患者CD3、CD4/CD8值較正常值明顯降低，機(jī)體自身免疫調(diào)節(jié)呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，從而可能出現(xiàn)機(jī)體免疫功能低下，以致免疫系統(tǒng)不能有效地識(shí)別抑制和清除病變細(xì)胞而導(dǎo)致本病的發(fā)生。

乳腺增生病屬于中醫(yī)“乳癖”范疇，多由情志內(nèi)傷、肝郁痰結(jié)、氣滯血瘀積聚乳房胃絡(luò)所致。《外科集驗(yàn)論》曰：“乳癖乃乳中結(jié)核，……多由思慮傷脾，惱怒傷肝，郁結(jié)而成?！薄锻饪漆t(yī)案匯編》曰：“治乳癥，不出一氣之，定之矣”。乳增寧膏是我院劉麗芳教授多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究所得，直接敷于病變部位，通過(guò)局部皮膚滲透和吸收作用及經(jīng)絡(luò)氣血的調(diào)節(jié)作用，以改善局部血運(yùn)，達(dá)到消腫止痛，軟化腫塊的目的。本研究選用苯甲酸雌二醇作為工具藥，在一定時(shí)期內(nèi)維持實(shí)驗(yàn)大鼠血中E2的高濃度，造成血中雌激素（E）比例失調(diào)，模型組的乳房和腺泡明顯增大，乳腺小葉和腺泡增多，導(dǎo)管上皮增生，其組織相與人類基本一致。且模型組與正常對(duì)照組比較雌二醇顯著增加，孕酮顯著減少，垂體促乳素水平升高。說(shuō)明在卵巢功能改變的同時(shí)，垂體功能也在發(fā)生改變，這與人類的病變相似。說(shuō)明成功復(fù)制出大鼠乳腺增生模型。研究結(jié)果顯示：乳增寧膏組，尤其是高劑量組能使乳腺組織對(duì)E的敏感性降低；還能調(diào)整孕激素的分泌不足，能升高血清中P，升高PRL，并與模型組比較有顯著性差異。孕激素水平的提高可以對(duì)抗雌激素引起的靶組織異常增生，對(duì)靶器官的結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[6,7]。結(jié)果還顯示乳增寧膏可抑制乳腺小葉和腺泡增多，抑制導(dǎo)管上皮增生；乳增寧膏對(duì)乳腺結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用與促進(jìn)孕酮功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中乳增寧膏組ER、PR含量顯著低于模型組，因而可以推測(cè)乳增寧膏是通過(guò)降低大鼠乳腺組織ER、PR含量使乳腺組織對(duì)E的敏感性下降，減弱E在靶細(xì)胞上的生物學(xué)效應(yīng)，從而產(chǎn)生抑制和治療乳腺增生的作用。且乳增寧高劑量組對(duì)各個(gè)免疫指標(biāo)有較為明顯的提高作用，有效提高機(jī)體自身的免疫功能。

綜上所述，乳增寧膏具有調(diào)節(jié)血清中E P、PRL激素水平的作用。其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的功能，從而改善血清性激素的異常而實(shí)現(xiàn)的。

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