養(yǎng)殖江團(tuán)體色改變的生化分析

陶青燕 張勇 李鑫 羅國(guó)強(qiáng)

從2002年起，各類(lèi)無(wú)鱗魚(yú)體色改變的現(xiàn)象在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)呈不斷高發(fā)的趨勢(shì)，一方面由于其發(fā)病迅速，明顯而迅速成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)；另一方面，由于其發(fā)病規(guī)律性較差，難于復(fù)制等特征，目前還未確定出其致病因子的分類(lèi)。變色魚(yú)的主要特征為黑色素的丟失，并因魚(yú)的品種不同而表現(xiàn)出各種奇異的體色。由于變色魚(yú)從視覺(jué)上難以被消費(fèi)者接受，從而給水產(chǎn)養(yǎng)殖，特別是特種水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于養(yǎng)殖魚(yú)體體色改變的原因還不甚清楚，其系統(tǒng)的研究?jī)H見(jiàn)于變色魚(yú)鱗片黑色素細(xì)胞的顯微觀察分析，而對(duì)于生產(chǎn)中變色頻率最高的無(wú)磷魚(yú)體色改變的生化研究還尚未見(jiàn)開(kāi)展。江團(tuán)學(xué)名長(zhǎng)吻鮠，是我國(guó)特有的優(yōu)良無(wú)鱗魚(yú)品種，具有肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特性。本研究擬采集變色江團(tuán)和正常體色江團(tuán)就可能影響黑色素形成的相關(guān)因子進(jìn)行比較研究，以探討引起無(wú)鱗魚(yú)體色改變的內(nèi)在生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在成都周邊漁場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)體重為250 g左右的健康江團(tuán)以及正處于體色異常階段的變色江團(tuán)各5尾。其中變色江團(tuán)體表黑色素部分脫落，呈斑塊狀，正常江團(tuán)體表色素分布均勻，自然，呈灰白色。

1.2 樣品采集

分別于尾靜脈處取各試魚(yú)的血液3 ml，4℃離心（3000 r/min,10 min）取血清，-20℃下保存待用。取各試魚(yú)肝胰臟，冰浴勻漿后放入液氮中保存待用。用手術(shù)刀取魚(yú)體背鰭后側(cè)背中線附近2×2 cm2的皮膚及魚(yú)體右側(cè)腹鰭后側(cè)2×2 cm2側(cè)的皮膚。魚(yú)皮剝離肌肉后，按照1：10(W/V)溶于pH值7.4冷的0.1 M的PBS緩沖液中冰浴勻漿，4℃培養(yǎng)3～12 h,在4℃下，12000 r/min,離心30 min，取得上清液，得到皮膚抽提液，凍存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定

肝臟中總蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮蘭法試劑盒（天根生化科技公司生產(chǎn)）；肝臟中還原型谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定參見(jiàn)還原型谷胱甘肽試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）；血清丙二醛（MDA）的測(cè)定參見(jiàn)MDA試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）；血清銅藍(lán)蛋白的測(cè)定參見(jiàn)銅藍(lán)蛋白試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）。

酪氨酸酶活性分析參照Z(yǔ)hang等(2000)[1]的方法進(jìn)行。酶的活力單位（unit）規(guī)定為，在試驗(yàn)條件下，每分鐘每毫克蛋白OD值增加0.001規(guī)定為一個(gè)酶活力單位。抽提液中蛋白濃度的測(cè)定同肝蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用T-Test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析（見(jiàn)表1、表2、表3）

表1 正常及變色江團(tuán)肝臟蛋白、肝臟GSH的含量

從表1可以看到，正常組肝蛋白的含量顯著高于變色組（P＜0.05）,而正常組肝中GSH含量顯著低于變色組（P＜0.05）。

表2 正常及變色江團(tuán)血清銅藍(lán)蛋白及MDA含量

從表2可以看出，正常組血清中銅藍(lán)蛋白的含量與變色組之間不存在顯著的差異，但變色組血清中MDA的含量極顯著的高于對(duì)照組（P＜0.01）。

表3 正常及變色江團(tuán)皮膚酪氨酸酶活性

從表3中可以看出，正常及變色江團(tuán)皮膚中酪氨酸酶的活性存在顯著差異，同一部位正常組明顯高于變色組，其背鰭后沿和腹鰭后沿皮膚處的酶活力均為變色組的3倍。

3 討論

我們?cè)谏a(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)銅離子在治療無(wú)鱗魚(yú)的變色方面表現(xiàn)出不穩(wěn)定的療效，而銅是酪氨酸酶的輔基，對(duì)于黑色素的形成具有重要作用，因此，無(wú)鱗魚(yú)體色的改變是否是由銅缺乏引起的，目前還未見(jiàn)報(bào)道。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，正常江團(tuán)與變色江團(tuán)的血清銅藍(lán)蛋白的含量之間不存在顯著差異，并且銅離子廣泛存在于養(yǎng)殖水體中。在常規(guī)養(yǎng)殖條件下，未見(jiàn)魚(yú)體銅缺乏癥的發(fā)生。這就基本排除了魚(yú)體因銅缺乏導(dǎo)致黑色素合成障礙的可能性。

已知MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物之一，其含量能直接反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度，并間接反映細(xì)胞損傷程度。而GSH作為機(jī)體重要的抗氧化防御物質(zhì)，在機(jī)體處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)能代償性的升高[2]。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，變色魚(yú)體內(nèi)MDA的含量極顯著的高于對(duì)照組，并且變色魚(yú)肝臟中GSH含量的代謝性增高以及肝臟蛋白質(zhì)含量的下降均與實(shí)驗(yàn)室條件下氧化損傷的生化改變相一致。早在1974年Murai[3]等就觀察到氧化魚(yú)油可使斑點(diǎn)叉尾鮰的皮膚色澤變淺，即氧化油脂可以影響黑色素的代謝。但整體皮膚顏色的變淺與局部或整體皮膚黑色素的丟失是否是同一問(wèn)題的不同表現(xiàn)形式目前還尚不清楚。

已知皮膚黑色素代謝的異?？赡苁莵?lái)源于合成功能的抑制或降解功能的亢進(jìn)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，變色魚(yú)相對(duì)于正常魚(yú)其皮膚中色素合成的關(guān)鍵酶活性顯著下降，這與葉元土等（2006）[4]觀察到變色魚(yú)鱗片中出現(xiàn)大量黑色素細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象相吻合。

目前尚有不少水產(chǎn)工作者認(rèn)為，變色魚(yú)僅在皮膚有病理變化而對(duì)魚(yú)體沒(méi)有損傷，從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，變色魚(yú)肝臟蛋白的含量顯著的低于正常組，表明肝臟存在嚴(yán)重的損傷。同時(shí)在臨床上可以看到部分變色魚(yú)的肝臟呈豆腐渣樣，并且魚(yú)體體表有比較嚴(yán)重的出血現(xiàn)象，若未及時(shí)治療，病程較長(zhǎng)的池塘也會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模的死亡。

在近年來(lái)的分析討論中，不少研究者將牙鲆等海水魚(yú)的白化與無(wú)鱗魚(yú)的體色改變?cè)谝欢ǔ潭壬蟿澚说忍?hào)。但在我們的研究及實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，這兩者之間是存在較大差異的。雖然同為皮膚色素異常，但鲆類(lèi)的白化往往發(fā)生在幼魚(yú)階段，其發(fā)病過(guò)程可能涉及細(xì)胞的分化，并且這種病理改變往往是不可逆的，相對(duì)于正常皮膚，白化的皮膚往往具有更高的酪氨酸酶活性[5]。而近年來(lái)多發(fā)的無(wú)鱗魚(yú)變色可發(fā)生于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的各個(gè)階段，并且在生產(chǎn)實(shí)踐中表現(xiàn)出明顯的可逆性，其黑色素的減少與皮膚中酪氨酸酶活性降低直接相關(guān)。因此，用鲆類(lèi)白化的研究成果來(lái)分析無(wú)鱗魚(yú)的變色可能是欠妥的。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，變色江團(tuán)相對(duì)于正常江團(tuán)體內(nèi)銅水平正常，變色江團(tuán)存在嚴(yán)重的氧化損傷，具體表現(xiàn)為血漿MDA水平的上升和GSH的代償性升高，而變色江團(tuán)皮膚酪氨酸酶活性的顯著下降并導(dǎo)致黑色素合成抑制是導(dǎo)致變色江團(tuán)皮膚黑色素丟失的直接生化原因。

[1]Zhang S C,Li G R..Presence of phenoloxidase and prophenoloxidase in epidermal cells and the epidermis mucus of the lancelet branchiostoma belcheritsingtauense[J].OPHELIA,2005,2(3):207-212.

[2]黃凱，阮棟儉，戰(zhàn)歌，等.氧化油脂對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)和抗氧化性能的影響[J].淡水漁業(yè),2006,36（6）：21－24.

[3]Murai T,Andrews J W.Interactions of dietary a-tocopherol,oxidized menhaden oil and ethoxyquin on channel catfish(Ictalurus punctatus)[J].J.Nutr.,1974,104:1416-1431.

[4]葉元土,郭建林,蕭培珍,等.養(yǎng)殖武昌魚(yú)體色與鱗片黑色素細(xì)胞初步觀察[J].飼料工業(yè),2006（22）.

[5]黃冰.大菱鲆白化病白化機(jī)理研究[D].中國(guó)海洋大學(xué)，2006.