LEN-5型β-內(nèi)酰胺酶基因的克隆及原核表達

盧月梅,張阮章,胡玉華,鐘運華,武學成,陳升汶,王沙燕

隨著抗生素的大量使用,病原菌產(chǎn)生多種耐藥機制以逃避抗生素的攻擊。β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上用得最多的抗生素,產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細菌對該類抗生素耐藥的最重要和最常見的機制。由于β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的突變,導致新型β-內(nèi)酰胺酶的不斷出現(xiàn)。LEN-5為本研究組首次發(fā)現(xiàn)于深圳市人民醫(yī)院臨床分離株的β-內(nèi)酰胺酶(GenBank登錄號為AY790341)〔1〕。為了進一步研究酶的特性,本研究對LEN-5基因進行原核表達。現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 含LEN-5質粒由深圳市人民醫(yī)院臨床分離株中獲得;pET26b(+)表達載體購于默克公司、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌 BL21(DE3)購自上海生工,SHV-1型標準產(chǎn)酶菌由陳民均教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 PCR引物由Invitrogen公司合成,限制性內(nèi)切酶 Nde I、Xho I、T4連接酶、高保真Pfu DNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品、膠回收試劑盒為QIAgen公司產(chǎn)品、異丙基硫代-β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、質粒提取試劑盒為BBI公司產(chǎn)品;Nitrocefin購自基因公司,兩性電解質載體凝膠(pH3～10)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。等電點標準(pH 3～10)為Amersham公司產(chǎn)品。凝膠純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction kit)為 QIAgen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增LEN-5基因 根據(jù)LEN-5編碼基因序列(gb|AY790341)設計PCR引物并分別引入Nde I和Xho I酶切位點。正向引物:5 -ATTGTGCATATGCGT TATATTCGCCTGTGTATTAT(劃線為 Nde I酶切位點),反向引物:5 -ATACTGCTCGAGGCGTTGCCAGTGCTCGATC(劃線為 Xho I酶切位點)。以含LEN-5基因的質粒DNA為模板進行 PCR反應。PCR反應條件為:95℃5min,接著 94℃45s、58℃45s、72℃60s,共 30個循環(huán),72℃延伸 10min。目的PCR產(chǎn)物為879bp。設大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照,SHV-1型標準產(chǎn)酶菌為陽性對照。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并照相。

1.2.2 pET-26b(+)/LEN-5重組質粒的構建和鑒定 LEN-5擴增產(chǎn)物和pET-26b(+)質粒分別用Nde I、Xho I雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠切膠純化,用T4連接酶于16℃連接過夜后,轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,再將轉化菌涂布于含卡那霉素(濃度30μ g/mL)的 LB平板上,于 37℃培養(yǎng)過夜,挑取單菌落擴增培養(yǎng),提取質粒,予酶切電泳鑒定,并對插入質粒載體中的目的片斷進行DNA測序。待確證插入片斷為目的基因后,將重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),用含卡那霉素的LB平板上進行篩選。該方案使重組的LEN-5基因在pET-26b(+)質粒T7啟動子的控制下,形成6×His的融合蛋白。

1.2.3 重組大腸桿菌BL21(DE3)的誘導 挑取確證的重組菌單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中,37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,吸取1mL加至30mL LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng),當菌體密度生長至OD600為0.6時,加入誘導劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,37℃振蕩4 h后,離心收集細胞并懸浮于0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)1.5mL中,冰浴中超聲破碎,參數(shù)為:750W,振幅 35%,處理2,間隔5s,共 8min。裂解液 13 000 r/min,4℃離心 30 min,上清液為β-內(nèi)酰胺酶粗提液。上清液用頭孢硝噻吩(Nitrocefin)檢測活性,如果細菌裂解液能使黃色頭孢硝噻吩(Nitrocefin)變?yōu)榧t色,表明細菌表達有活力的酶。

1.2.4 等電點的測定 為了避免6×his標簽對β-內(nèi)酰胺酶等電點的影響,針對基因序列重新設計反向引物,使反向引物位于終止密碼子之外,引物為5-ATACTGCTCGAGCCAGTCATATCGCCCGGCAC(劃線為Xho I酶切位點),與上述正向引物配對重新對PCR產(chǎn)物進行克隆和表達(方法同上),表達產(chǎn)物用于等電點的測定,取β-內(nèi)酰胺酶粗提液2μL,與等電點標準品同時進行電泳,用Model III Mini IEF Cell電泳儀(BIO-RAD公司)進行等電聚焦電泳,電泳條件如下:先100V電泳15min。之后增加電壓到200V電泳 15min。最后450V電泳60min。電泳結束后先用頭孢硝噻吩(nitrocefin)染色,測量條帶至陽極的距離,再用考馬斯亮藍染色,測各PI標準條帶至陽極的距離并繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算β-內(nèi)酰胺酶LEN-5的等電點(PI)。

2 結 果

2.1 LEN-5基因PCR擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在約 800～900bp位置出現(xiàn)一條帶(圖1),與引物設計的擴增片段基本吻合(圖1)。

圖1 LEN-5基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 electropherogram of LEN-5 gene PCR amplification

2.2 pET26b(+)/LEN-5重組質粒的鑒定和表達由重組DH5α大腸桿菌中提取重組質粒pET26b(+)/LEN-5,經(jīng) Nde I和Xho I雙酶切后得到861 bp和5230 bp兩條片段(圖2),對插入的目的基因的測序結果與預期序列完全一致,表明LEN-5基因已成功克隆。BL21(DE3)重組菌經(jīng)誘導后,取 2μL重組菌裂解液加入1μL頭孢硝噻吩(1 mmol/L)中,幾秒鐘后頭孢硝噻吩由黃變紅,而轉入空質粒的陰性菌裂解液不能使之變色,確證重組質菌構建成功,且其表達產(chǎn)物具有酶活力。

2.3 LEN-5等電點的檢測 根據(jù)等電點(pI)標準蛋白各條帶與陽極的距離,應用SPSS軟件13.0進行線性回歸,以條帶與陽極的距離為自變量(X),pI為因變量(Y),獲得回歸方程Y=0.024X+4.86,根據(jù)表達產(chǎn)物與陽極的距離算出PI為7.6(圖3)。

3 討 論

LEN 型 β-內(nèi)酰胺酶由 Yoshichika等〔2〕在 1986年首次報道,他們從一株肺炎克雷伯菌株(LEN-1)染色體DNA中克隆出一種β-內(nèi)酰胺酶基因,發(fā)現(xiàn)它可導致菌株對氨芐青霉素耐藥,因此將該β-內(nèi)酰胺酶稱為LEN-1。研究顯示LEN-1屬于A類,2 a組β-內(nèi)酶胺酶,主要由肺炎克雷伯菌染色體基因編碼產(chǎn)生,其編碼基因產(chǎn)生的蛋白質含279個氨基酸,等電點為7.1。與質粒介導的 TEM-1 β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列同源性為 67%〔2〕。

本次研究的LEN-5型酶與LEN-1差異較大,如LEN-5含286個氨基酸,其等電點為7.6,兩者氨基酸序列同源性為96.2%〔1〕。氨基酸序列的差異可導致β-內(nèi)酰胺酶特性的變化,為了獲得高產(chǎn)量、高純度的β-內(nèi)酰胺酶以便進一步分析酶的特性,本實驗選用PET-26b(+)質粒對LEN-5基因進行了克隆及原核表達,表達產(chǎn)物為帶6×His標簽的融合蛋白,帶這種His標簽的融合蛋白方便了下游的純化,通過親和層析法可獲得高純度LEN-5酶。由于一株細菌可同時產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶〔3-4〕,與天然產(chǎn)酶菌相比,應用基因工程技術表達該酶可以避免多種β-內(nèi)酰胺酶的相互干擾 ,更確切地研究該β-內(nèi)酰胺酶的性質。PET-26b(+)/LEN-5表達載體的成功構建和表達,為進一步研究酶動力學以及其它特性奠定了基礎。

〔1〕Chen SW,Zhang RZ,Lu YM,et al.A novel LEN-derived β-lactamase from K lebsiela pneumoniae〔J〕.Chin Med J,2005,118(16):1380-1383.

〔2〕Arakawa Y,Ohta M,Kido N,et al.Close evolutionary relationship between the chromosomally encoded β-lactamase gene of K lebsiella pneumoniae and the TEM-1β-lactamase gene mediated by R-plasmids〔J〕.FEBS Lett,1986,207(1):69-74.

〔3〕盧月梅,陳升汶,何林,等.呼吸道產(chǎn)ESBLs分離株耐藥基因的研究〔J〕.中國微生態(tài)學雜志,2004,16(6):340-341.

〔4〕Tofteland S,Haldorsen B,Dahl K,et al.Effects of phenotype and genotype on methods for detection of extended-spectrum-βlactamase-producing clinical osolates of Escherichia coliand K lebsiella pneumoniae in Norway〔J〕.J Clin Microbiol,2007,45(1):199-205.