黃皮洋蔥寡糖提取工藝的研究

田 園，史美麗，劉錦梅

(青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東 青島 266109)

寡糖是由2～10個單糖通過糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈的低度聚合糖，有功能性寡糖和普通寡糖之分。功能性寡糖具有獨特的生理活性，能顯著改善脂質(zhì)、降低血清膽固醇、提高人體免疫力、分解致癌物、促進腸道蠕動、防止便秘[1]。天然植物中含有未曾發(fā)現(xiàn)和認知的新型寡糖，因此篩選含有寡糖的天然植物以及進行天然寡糖的提取分離等研究對生命科學的發(fā)展具有一定的學術(shù)意義。

洋蔥(AlliumcepaL.)，別名玉蔥，為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物[2]，其活性成分洋蔥寡糖可提高機體免疫力，激活巨噬細胞的吞噬活性，對預防、抑制和殺死腫瘤細胞有重要作用[3]。在飼料中添加適量洋蔥寡糖，可顯著提高肉雞的日增重、降低肉雞大腸糞便中NH3-N含量[4]。作者以黃皮洋蔥為原料提取洋蔥寡糖，優(yōu)化了洋蔥寡糖提取及分離純化工藝，以期為洋蔥寡糖結(jié)構(gòu)表征和生理活性研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 原料、試劑與儀器

黃皮洋蔥，市售。

正丁醇、氯仿、無水乙醇，分析純，萊陽市康德化工有限公司；蒽酮，分析純，上海市五聯(lián)化工廠；活性炭，珠海市懷玉山活性炭科技有限公司；Sephadex G-25，上海藍季科技發(fā)展有限公司；葡萄糖，分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠； 考馬斯亮藍G250，分析純，上海如吉生物技術(shù)有限公司。

DF-Ⅱ型集熱式恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市恒豐儀器廠；752型紫外分光光度計、AR2140型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；DBS-100型電腦全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；B-260型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；S21-4型恒溫水浴鍋，上海悅豐儀器儀表有限公司；真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；干燥烘箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料含水量及寡糖含量的測定

分別稱取新鮮洋蔥33.1200 g、23.5600 g、15.6100 g，置于50℃烘箱中干燥至恒重，計算平均含水量(以總質(zhì)量計，下同)。

精確稱取洋蔥50.0000 g，組織破碎勻漿，用4 BV的95%乙醇洗滌(除去可溶性單糖)，抽濾，濾渣重復洗滌2次，加水，在料液比為1∶4(g∶mL，下同)、提取溫度為70℃、提取時間為90 min的條件下提取得到洋蔥寡糖液，重復提取3次，合并提取液，旋蒸濃縮，濃縮液加水溶解定容至250 mL，取1 mL溶液，采用蒽酮-硫酸比色法測定寡糖含量。平行測定3次。

1.2.2 標準曲線的繪制[5]

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖50.00 mg置于50 mL容量瓶中，加純凈水溶解，定容至刻度，搖勻，即得1.0 g·L-1葡萄糖標準溶液。

精確移取葡萄糖標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。分別取上述溶液1.0 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，然后放入熱水浴中，具塞，煮沸10 min，自來水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，用紫外分光光度計在620 nm波長處測定吸光度。以糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖的標準曲線

1.2.3 洋蔥寡糖提取單因素實驗

精確稱取50 g洋蔥，組織破碎勻漿，以提取溶劑、提取次數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度為單因素變量提取洋蔥寡糖，提取液旋蒸濃縮，濃縮液醇沉，離心、干燥，得粗寡糖；粗寡糖水溶，定容至250 mL；取1 mL，采用蒽酮-硫酸比色法測定寡糖含量，考察各單因素對寡糖提取率的影響。

1.2.4 洋蔥寡糖提取正交實驗

以水為提取溶劑，以寡糖提取率為考察指標，選擇料液比 、提取時間、提取溫度為考察因素，采用L9(34)正交實驗優(yōu)化提取工藝。正交實驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素及水平

1.2.5 洋蔥寡糖的分離純化

采用活性炭脫色法處理寡糖提取液。以紫外可見分光光度計在570 nm處測定寡糖提取液脫色前后吸光度，按下式計算脫色率。

同時用蒽酮-硫酸比色法測定脫色前后寡糖的含量，計算寡糖回收率。確定最佳脫色工藝。

式中：M前、M后分別為脫色前后的寡糖含量。

脫色后的溶液采用Sevag法脫蛋白。加入體積分數(shù)為20%的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇= 4∶1)，混合，振蕩，蛋白質(zhì)及有機相從分液漏斗下部除去。采用考馬斯亮藍比色法[6]測定溶液中蛋白質(zhì)的含量，以脫蛋白次數(shù)為變量，測定3、4、5次操作后溶液中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.6 凝膠色譜法純化、分級制備寡糖純品[7]

色譜條件：葡聚糖凝膠Sephadex G-25，色譜柱長80 cm、直徑1.5 cm，流動相為0.05 mol·L-1氯化鈉溶液，進樣量 10 mL，流速0.3 mL·min-1，以DBS-100電腦全自動部分收集器收集。

寡糖提取液經(jīng)活性炭脫色、Sevag法脫蛋白、5 BV 95%的乙醇沉淀、冷凍干燥后以水溶解，進行凝膠柱層析。收集液以蒽酮-硫酸比色法確定寡糖的部位，合并寡糖部位收集液，濃縮醇沉，離心，冷凍干燥，計算寡糖回收率，用蒽酮-硫酸比色法測定產(chǎn)品純度。

1.2.7 提取樣品中寡糖含量的測定

取1 mL樣品提取液置于100 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，取1 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，冰水浴冷卻，具塞煮沸10 min，自來水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在620 nm波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 新鮮黃皮洋蔥含水量及寡糖含量

經(jīng)測定，新鮮黃皮洋蔥含水量為90.75%、寡糖含量為4.09%。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 溶劑的選擇

寡糖是極性分子，可采用極性溶劑水或強極性的鹽溶液作提取溶劑。將50 g洋蔥勻漿液在料液比為1∶4、提取時間為90 min、提取溫度為70℃的條件下，以不同的溶劑(0.8 mol·L-1鹽水溶液)進行提取，考察其對洋蔥寡糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 溶劑對寡糖提取率的影響

由圖2可知，溶劑對提取率的影響不大，強極性的鹽溶液和水作溶劑時，寡糖的提取率基本相當，說明水的極性已能滿足完全提取寡糖的要求。故確定洋蔥寡糖的提取溶劑為水。

2.2.2 提取次數(shù)的確定

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在料液比為1∶4、提取時間為90 min、提取溫度為70℃的條件下進行提取，考察提取次數(shù)對寡糖提取率的影響，結(jié)果見表2。

表2 浸提次數(shù)對寡糖提取率的影響

由表2可知，提取2次時寡糖提取率為5.65%，提取基本完全。因此，確定提取次數(shù)為2次。

2.2.3 料液比的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取溫度為70℃、提取時間為60 min的條件下重復提取2次，考察料液比對寡糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對寡糖提取率的影響

由圖3可知，隨溶劑用量的增大，寡糖的提取率不斷上升；當料液比達到1∶4后，提取率趨于穩(wěn)定。這是因為，溶劑用量較小時，寡糖溶解不完全；隨著溶劑用量的增加，寡糖溶解浸出量增大；當溶劑用量足夠溶解所有寡糖時，繼續(xù)增加溶劑用量，提取率變化不大。故選擇料液比為1∶(3～5)進行正交優(yōu)化實驗。

2.2.4 提取時間的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取溫度為70℃、料液比為1∶4的條件下重復提取2次，考察提取時間對寡糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對寡糖提取率的影響

由圖4可知，提取時間越長，寡糖提取率越高；提取90 min時提取率達到最大；之后提取率隨時間的延長而下降。提取過程非常復雜，融合浸泡、擴散、滲透、溶解、再擴散、平衡等步驟，需要較長的時間，但提取時間過長，會造成提取液中部分寡糖分解，導致提取率下降。故選擇提取時間為70～90 min進行正交優(yōu)化實驗。

2.2.5 提取溫度的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取時間為60 min、料液比為1∶4的條件下重復提取2次，考察提取溫度對寡糖提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對寡糖提取率的影響

由圖5可知，寡糖提取率隨提取溫度的升高而上升；提取溫度為60℃時提取率達到最大；提取溫度高于60℃時，提取率反而降低。這是因為提取溫度過高，會導致溶液中寡糖對熱的不穩(wěn)定性而分解。故選擇提取溫度為50～70℃進行正交優(yōu)化實驗。

2.3 正交實驗結(jié)果與分析(表3)

由表3可知，各因素對洋蔥寡糖提取率的影響大小依次為B>C>A，最佳提取工藝條件是A2B2C3，即料液比1∶4 、提取時間80 min、提取溫度70℃，此時，洋蔥寡糖的提取率達70.19%。

2.4 洋蔥寡糖的分離純化

2.4.1 活性炭脫色

表3 正交實驗結(jié)果與分析

實驗發(fā)現(xiàn)，當活性炭添加量(活性炭/提取液)為2.5 g·L-1、脫色時間為20 min、脫色溫度為70℃時，脫色率為85.48%、寡糖回收率為85.13%。

2.4.2 Sevag法脫蛋白

實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3、4、5次Sevag法脫蛋白后，寡糖提取液的蛋白質(zhì)含量由18.763 μg·mL-1分別降至9.246 μg·mL-1、1.269 μg·mL-1、0.997 μg·mL-1，表明經(jīng)4次Sevag法處理，即可完全去除蛋白質(zhì)。

2.5 凝膠色譜法制備寡糖純品(圖6)

由圖6可以看出，洋蔥寡糖在50～100 mL之間有單一對稱洗脫峰，寡糖的回收率為71.35%、純度為99.61%。

3 結(jié)論

(1)單因素實驗和正交實驗表明，以水為溶劑提取洋蔥寡糖時，各因素對寡糖提取率影響大小依次為：提取時間>提取溫度>料液比。優(yōu)化的提取工藝條件為：料液比 1∶4(g∶mL)、提取溫度70℃、提取時間80min。在此條件下提取2次，寡糖提取率為70.19%。

圖6 Sephadex G-25柱層析

(2) 采用活性炭脫色，當活性炭用量(活性炭/提取液)為2.5 g·L-1、脫色時間為20 min、脫色溫度為70℃時，脫色率為85.48%、寡糖回收率為85.13%。經(jīng)4次Sevag法處理可完全去除蛋白質(zhì)。5 BV的95%乙醇可使寡糖沉淀完全。

(3) 經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析純化分級，寡糖回收率為71.35%、純度為99.61%。

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