大曲中毛霉產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件的研究

李蘭,蔣愛鳳

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

蛋白酶是酶制劑工業(yè)中最重要的工業(yè)酶之一,由于其用途廣泛,商業(yè)價(jià)值高,蛋白酶一直是開發(fā)和研究的熱點(diǎn)[1].蛋白酶分動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶,動(dòng)物蛋白酶生產(chǎn)周期長(zhǎng)價(jià)格昂貴,植物蛋白酶原料的生產(chǎn)受土地資源與季節(jié)限制,與這兩種蛋白酶相比,微生物來源的蛋白酶具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、易于管理控制、不受土地和季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)[2],因此,采用發(fā)酵工程技術(shù)是生產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良方法.用于食品生產(chǎn)的蛋白酶可以由多種微生物產(chǎn)生,如地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞桿菌（B.subtilis）、灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、寄生曲霉（A.parasiticus）、米曲霉（A.oryzae）、微小毛霉（Mucorpusillus）等[3],其中毛霉含有非常豐富的酶系,僅就蛋白酶而言,可產(chǎn)生酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶,既能合成端肽酶,又能分泌內(nèi)肽酶,因此,毛霉蛋白酶本身是一種天然的復(fù)合酶系[4].毛霉蛋白酶特別適宜于各種發(fā)酵食品及大豆多肽的制作,已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)[5,6].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 毛霉：河南某酒廠大曲中分離純化得到；斜面培養(yǎng)基：采用PDA培養(yǎng)基[7]；固體發(fā)酵培養(yǎng)基：250 mL的三角瓶中按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同量麩皮,與不同比例的水混合均勻,121℃高溫高壓滅菌30 min,趁熱搖散,備用.

1.1.2 試劑 福林試劑（Folin試劑）；pH 3.0乳酸緩沖液；pH 7.5的磷酸緩沖液；pH 10.5的硼酸緩沖液等；所用試劑均為分析純.

1.1.3 儀器 電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；手提式電熱蒸汽消毒器（山東安得醫(yī)療科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（德國Sigma公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市三水科學(xué)儀器有限公司）；722型紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離 將大曲粉碎,取少量曲粉,以適量體積的無菌水浸泡,加入少量蔗糖,對(duì)菌種進(jìn)行富集培養(yǎng).用PDA培養(yǎng)基對(duì)富集后的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋,進(jìn)行平板分離.待平板上長(zhǎng)滿單菌落后,取目的菌種接入斜面,于28℃培養(yǎng)2～3 d,即為斜面菌種[8].

1.2.2 毛霉菌種固體培養(yǎng) 在斜面菌種加入10 mL無菌水,充分振蕩1 min,用移液管吸取1 mL菌懸液,加入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃培養(yǎng)箱中按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)不同時(shí)間,即得麩曲.

1.2.3 粗酶液的制備 稱取5 g曲子,放入研缽中,加入0.3 mol/L的NaCl溶液,搗碎,定容到100mL容量瓶中,40℃浸提30 min.取浸提液在3 000 r/min離心20 min,取上清液進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定.

1.2.4 酶活力的測(cè)定 中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——酶活力測(cè)定法[9].

圖1 產(chǎn)酶活力的動(dòng)態(tài)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 毛霉產(chǎn)酶動(dòng)態(tài)

按照毛霉菌種固體培養(yǎng)方法進(jìn)行毛霉發(fā)酵,依次于 24、48、72、96、120 h取樣分別測(cè)量堿、中、酸性蛋白酶的活力,每次測(cè)量作3個(gè)重復(fù),取平均值.產(chǎn)酶動(dòng)態(tài)如圖1所示.

由圖1可見毛霉產(chǎn)蛋白酶以堿性蛋白酶為主,72 h產(chǎn)酶活最高.酸、中性蛋白酶在前期基本不產(chǎn)生,后期產(chǎn)量也沒有堿性蛋白酶高.產(chǎn)酶增長(zhǎng)最快的時(shí)期是48～72 h,這個(gè)時(shí)間段也是孢子生長(zhǎng)最為旺盛的時(shí)期.

由于此毛霉所產(chǎn)蛋白酶以堿性蛋白酶為主,因此在以下的單因素實(shí)驗(yàn)中都以所測(cè)得的堿性蛋白酶為指標(biāo).

2.2 料水比對(duì)產(chǎn)酶的影響

稱取5g麩皮,以不同的加水量配置料水比分別為1∶1,1∶1.2,1∶1.4,1∶1.6,1∶1.8,1∶2,1∶2.2的培養(yǎng)基,于28℃培養(yǎng)72 h后測(cè)酶活.料水比對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖2所示.

圖2 料水比對(duì)堿性蛋白酶的影響

由圖2可見培養(yǎng)基的最合適含水量為61.55%,即麩皮∶水＝1∶1.6配置的培養(yǎng)基.毛霉生長(zhǎng)需要一定量的水分,但含水量不宜過高.因?yàn)楦吆颗囵B(yǎng)基的曲子容易粘結(jié)成團(tuán),導(dǎo)致散熱困難,而毛霉又是低溫生長(zhǎng)的菌種,一旦散熱不好極容易燒曲,酶活力自然不高.所以培養(yǎng)基含水量要控制在一定的范圍內(nèi)才適合毛霉產(chǎn)蛋白酶.

2.3 扣瓶對(duì)產(chǎn)酶的影響

制作7瓶固體培養(yǎng)基進(jìn)行毛霉菌種固體培養(yǎng),分別標(biāo)號(hào)為 1、2、3、4、5、6、7號(hào),其中1號(hào)不扣瓶作為對(duì)照,另外6個(gè)在培養(yǎng) 12 h 后,2、3、4、5、6、7 號(hào)瓶在后 60 h培養(yǎng)過程中,依次扣瓶 2、3、4、5、6次,培養(yǎng)72 h后測(cè)定酶活.扣瓶對(duì)產(chǎn)酶活力的影響如圖3所示.

圖3表明,一定次數(shù)的扣瓶處理可以提高酶的產(chǎn)量,但是多次扣瓶處理沒有提高酶產(chǎn)量的作用,有可能是扣瓶次數(shù)太多了,打碎了曲子菌絲,不利于菌絲體生長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降.經(jīng)觀察,扣瓶處理的曲子碎散,不扣瓶的曲子密實(shí)整齊.最高酶活出現(xiàn)的時(shí)候,菌體生長(zhǎng)也是最旺盛的時(shí)候,這充分說明了良好的菌絲體生長(zhǎng)有利于高產(chǎn)酶活.

2.4 麩皮裝量對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別稱取 5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 g麩皮于 250 mL三角瓶中，按照麩皮與水分 1：1.6比例制作培養(yǎng)基,于28℃培養(yǎng)72 h后測(cè)酶活.麩皮裝量對(duì)產(chǎn)堿性蛋白酶的影響如圖4所示.

由圖4可以看出麩皮裝量為5 g的時(shí)候酶活最大,隨著麩皮裝量的增加產(chǎn)酶活力減少.充足的氧含量及良好的散熱水平有利于菌絲的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶,同樣的空間,少的裝量可以獲得大量的氧供應(yīng),同時(shí)也利于散熱,防止品溫過高影響菌絲生長(zhǎng),防止造成燒曲.麩皮裝量為7.5 g時(shí)酶活與5 g之相當(dāng),說明這時(shí)已經(jīng)有足夠的供氧、通風(fēng)及散熱,因此如果250 mL三角瓶麩皮裝量少于5 g的話,會(huì)造成空間的浪費(fèi),從而會(huì)減少酶的產(chǎn)量,在工業(yè)上就會(huì)表現(xiàn)為經(jīng)濟(jì)效益損失.

2.5 四因素三水平正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用四因素三水平進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

圖3 扣瓶次數(shù)對(duì)堿性蛋白酶的影響

圖4 麩皮裝量對(duì)堿性蛋白酶的影響

表1 四因素三水平正交設(shè)計(jì)

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由極差分析可以看出,各因素影響堿性蛋白酶活力順序?yàn)椋築＞C＞D＞A,即培養(yǎng)基的含水量是影響堿性蛋白酶活力的主要因素,其次是扣瓶次數(shù),然后是麩皮裝量和培養(yǎng)時(shí)間.產(chǎn)堿性蛋白酶最適條件組合為：A2B3C3D1,即培養(yǎng)72 h,含水量64.3%,扣瓶4次,250 mL三角瓶裝入麩皮5 g.

將正交試驗(yàn)所得的最佳組合A2B3C3D1做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測(cè)定酶活力平均值為846 U/g.

3 結(jié)論

3.1 通過毛霉產(chǎn)酶動(dòng)態(tài)的產(chǎn)堿性、中性、酸性酶活性測(cè)定,表明從大曲中分離出的毛霉產(chǎn)蛋白酶以堿性蛋白酶為主,其次是中性蛋白酶,產(chǎn)酸性蛋白酶最少.

3.2 通過正交實(shí)驗(yàn)分析,可以得到最佳發(fā)酵條件為：麩曲培養(yǎng)時(shí)間72 h,固體培養(yǎng)基含水量為64.3%,培養(yǎng)期間扣瓶4次,250 mL三角瓶裝入麩皮5 g為產(chǎn)酶最好.

3.3 在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行毛霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶達(dá)846 U/g.

[1]陳濤.毛霉蛋白酶的制備及水解豆粕的研究[D].武漢：華南理工大學(xué),2004.

[2]張樹政.酶制劑工業(yè)（第3版）[M].北京：科學(xué)出版社,1998.

[3] 胡學(xué)智.蛋白酶的生產(chǎn)和應(yīng)用（上）[J].江蘇調(diào)味副食品,2006,23（6）：1-4,22.

[4]潘進(jìn)權(quán),沈月榮,李理,等.固體發(fā)酵制備毛霉蛋白酶的研究[J].中國調(diào)味品,2006,（3）：9-13.

[5]于麗萍.大豆多肽開發(fā)應(yīng)用潛力巨大[J].杭州化工,2003,33（1）：40.

[6]李理,潘進(jìn)權(quán),楊曉泉,等.液體發(fā)酵法制備風(fēng)味良好的大豆多肽[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29（1）：23-26.

[7]陳濤,劉耘,李理,等.毛霉M4固體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的研究[J].中國釀造,2004,（4）：16-18.

[8]周德慶.微生物學(xué)教程[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社,1987：82-87.

[9]須鳳高.中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——酶活力測(cè)定法[S].中華人民共和國共和國商業(yè)部,1987.