分子糞便學(xué)在瀕危野生動(dòng)物研究中的應(yīng)用

李秦豫,艾斯卡爾·買買提,肖白樺,馬合木提·哈力克

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊,830046）

近年來(lái),隨著生態(tài)環(huán)境的不斷惡化和對(duì)野生動(dòng)物的亂捕濫殺,許多野生動(dòng)物的種群數(shù)量下降,越來(lái)越多的動(dòng)物到了瀕臨滅絕的境地,而人們需要更多的了解這些動(dòng)物,以制定適宜的保護(hù)和管理措施.但是由于這些野生動(dòng)物處于瀕危狀態(tài),這就意味著傳統(tǒng)的取樣方法已經(jīng)不再適用了.為了避免取樣對(duì)野生動(dòng)物的傷害,一種新的取樣方法——非損傷取樣（Noninvasive sampling）應(yīng)用而生.這種方法可以在不觸及或傷害野生動(dòng)物本身的情況下,通過(guò)收集其自然脫落的毛發(fā)、糞便、尿液、食物殘?jiān)?、鱗片和卵殼等不同形式的分析樣品而進(jìn)行遺傳分析的一種取樣方法[1].在所有的非損傷性取樣中,收集糞便樣品對(duì)動(dòng)物的干擾最小,且最容易收集,因此利用糞便樣品來(lái)獲取基因組DNA,然后借助PCR技術(shù)和多種分子標(biāo)記,從而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行遺傳分析是最具潛在應(yīng)用價(jià)值的.

1 糞便作為DNA研究材料的可行性

野生動(dòng)物的糞便中的主要成分是一些未消化的食物殘?jiān)?這些食物殘?jiān)诮?jīng)過(guò)腸道時(shí)經(jīng)常會(huì)夾雜有大量脫落的腸道上皮細(xì)胞一起排除體外.研究表明,每g人的新鮮糞便中會(huì)含有105個(gè)腸道細(xì)胞[2],且大部分是活細(xì)胞.這意味著理論上可以從糞便中獲取糞便生產(chǎn)者的DNA進(jìn)行遺傳分析,如RFLP,RAPD和AFLP,SSCP以及微衛(wèi)星標(biāo)記等,這對(duì)于瀕危野生動(dòng)物的遺傳多樣性研究有著非常重要的意義.同時(shí)糞便中還含有線粒體DNA,而線粒體DNA主要來(lái)自受精卵的卵母細(xì)胞,因此糞便DNA還是母系遺傳的良好材料.雖然糞便DNA不可避免的存在著一定程度的降解,然而隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)能夠從質(zhì)量不高的DNA模板中擴(kuò)增出目的片段,這就意味著分子糞便學(xué)在方法上已經(jīng)日趨成熟,并進(jìn)入了實(shí)際的應(yīng)用階段.Hoss等人發(fā)表了第一篇關(guān)于從熊的糞便中獲取DNA的文章,標(biāo)志著糞便DNA分析技術(shù)的建立,并開(kāi)始為動(dòng)物生態(tài)學(xué)和保護(hù)遺傳學(xué)提供有價(jià)值的材料[3].Reed等人通過(guò)抽提海豹糞便DNA來(lái)分析海豹的種類、性別、個(gè)體還有食性和寄生蟲(chóng)分析,首次提出了分子糞便學(xué)（Molecularscatology）的概念[4],即將傳統(tǒng)的糞便分析方法與分子生物學(xué)相結(jié)合的一種全新的取樣分析方法.

2 糞便DNA的研究方法

2.1 糞便的采集

糞便樣本的采集是整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程的第一步,直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞.研究人員發(fā)現(xiàn)從新鮮樣品中提取的DNA要比陳舊樣品中提取的DNA擴(kuò)增效果要好,而且在冬季采集的樣品效果要比在夏季采集的更有利于遺傳多樣性的分析[5].但是由于野生動(dòng)物在野外的排便是隨機(jī)的,要獲取新鮮的糞便樣本有一定的困難,因此在取樣之前要進(jìn)行詳細(xì)的方案設(shè)計(jì).在冬季沿著野生動(dòng)物的雪地足跡收集樣品,將會(huì)明顯的提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度.對(duì)采集地點(diǎn)事先進(jìn)行實(shí)地考察,了解野生動(dòng)物的主要活動(dòng)地域和活動(dòng)時(shí)間,盡可能第一時(shí)間采取糞便樣本.采樣時(shí)并不一定要采集整個(gè)糞便,對(duì)于大型哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō),可以僅采集糞便外表的粘膜層就足以供DNA提取,這部分所含細(xì)胞較多,雜質(zhì)少,可以獲取純度較高的DNA.為了避免樣品的交叉污染,采集時(shí)應(yīng)帶一次性器具,采集到的每一粒都要分別進(jìn)行分裝,避免損傷糞便顆粒表層,以保證目的DNA的質(zhì)量.做好標(biāo)記,注明采集地點(diǎn)、時(shí)間、坐標(biāo)、采樣時(shí)的天氣（溫度和濕度）及該區(qū)域的食物組成.

2.2 糞便的保存

糞便在采集后須盡快保存.在保存糞便的過(guò)程中,首先應(yīng)避免DNA的降解.由于核酸內(nèi)切酶被認(rèn)為是降解DNA的主要因素,因此大多數(shù)保存方法都是為了降低其核酸內(nèi)切酶的活性[6]；其次因?yàn)椴杉S便的地點(diǎn)一般都是在野外,因此糞便的保存方法應(yīng)該便于野外使用和運(yùn)輸,而且對(duì)于不同物種及物種的不同生境,保存的方法也應(yīng)有所區(qū)別.目前糞便的保存方法主要有冷凍法[7-8]、干燥法[9-11]、乙醇保存[12-14]、硅珠保存[15]、福爾馬林保存[16]、二甲基砜（DMSO）保存[17].

不同的保存方法對(duì)提取DNA的質(zhì)量有較大的影響,在對(duì)狒狒的糞便DNA分析時(shí)發(fā)現(xiàn),DETs（DMSO/EDTA/Tris鹽溶液）保存法對(duì)核基因有明顯得保存效果,而干燥保存和乙醇保存對(duì)線粒體DNA有較好的效果[18].在國(guó)內(nèi)從不同方法保存的東北馬鹿糞便中提取DNA,認(rèn)為低溫冷凍法可靠易行,而乙醇保存和干燥保存的樣品中提取的目的DNA質(zhì)量較低,分析其原因是酒精作為一種抑制劑,在PCR時(shí)抑制了反應(yīng)的進(jìn)行[19]；干燥法在干燥過(guò)程中樣品可能被污染或表皮脫落致使PCR質(zhì)量較差,在澳大利亞兩種食草動(dòng)物和三種食肉動(dòng)物的糞便研究中發(fā)現(xiàn)干燥保存和冷凍保存有著更好的效果[20].這說(shuō)明了在不同物種和不同生境中,最適保存方法也是有所區(qū)別的.

2.3 糞便DNA的提取

糞便DNA是由其生產(chǎn)者少量脫落的上皮細(xì)胞抽提而出,而這些細(xì)胞是處在一個(gè)潮濕而且成分復(fù)雜的環(huán)境中,不僅含有大量的腸道微生物,而且還有未消化的食物、消化酶、膽堿、膽紅素等[21],在食草動(dòng)物中還含有多糖,這些都會(huì)影響糞便DNA的提取和擴(kuò)增[22].因此,如何有效的去除糞便樣品中的各種抑制劑,是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵.目前國(guó)內(nèi)外從糞便中提取DNA應(yīng)用的最為廣泛的方法主要有以下四種：

2.3.1 試劑盒提取 現(xiàn)在公認(rèn)的用于糞便DNA提取的試劑盒效果最好的是德國(guó)Qiagen生產(chǎn)的試劑盒QIAamp DNA Stool Kit.這種方法操作簡(jiǎn)單,用時(shí)少,而且去除抑制物的效果很好.但是價(jià)格比較昂貴,而且因?yàn)閷＠?試劑中的成分及含量不是很清楚,如果操作失敗,分析原因也是一件比較困難的事情,并且不同動(dòng)物的食性和采集糞便時(shí)的自然環(huán)境不同,影響DNA提取因素的差異較大,因此針對(duì)不同的動(dòng)物應(yīng)該加以適當(dāng)?shù)母倪M(jìn).

2.3.2 硫氰酸胍（GuSCN）-二氧化硅（SiO2）法 GuSCN是一種很強(qiáng)的蛋白變性劑,可以使細(xì)胞裂解,使核酸水解酶失活.當(dāng)GuSCN濃度較高的時(shí)候,二氧化硅顆?？梢蕴匾庑晕紻NA,從而可以直接提出高純度的DNA而避免一些干擾因子,達(dá)到純化DNA的目的.用此方法成功的從海豹糞便中抽提出高質(zhì)量的DNA,并以此分辨了海豹的種,性別和個(gè)體[4].在對(duì)歐洲獾的研究中也用此方法從糞便中提取了高質(zhì)量的模板[13].

2.3.3 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法 CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑,它能與蛋白質(zhì)和大多數(shù)多糖形成復(fù)合物,從而使DNA與多糖分開(kāi),再用乙醇沉淀DNA可出去CTAB從而得到純度較高的DNA.因此,利用CTAB來(lái)處理一些植食性動(dòng)物的糞便,可以有效的去除多糖等糞便中主要影響PCR的雜質(zhì).在用蛋白酶K裂解糞便的同時(shí)加入CTAB,得到的DNA產(chǎn)物可成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7].

2.3.4 預(yù)處理－有機(jī)溶劑法 在裂解前用丙酮,乙醇或者水預(yù)處理糞便,可以將糞便中的色素,多糖及一些有機(jī)鹽等PCR抑制物除去,在通過(guò)常規(guī)的有機(jī)溶劑抽提方法提取出DNA,其效果明顯優(yōu)于未處理的糞便DNA.將此方法與多管法相結(jié)合,在無(wú)水乙醇常溫保存4.5年的短尾猴糞便中提取DNA獲得了成功[23].

3 糞便DNA在瀕危野生動(dòng)物保護(hù)中的應(yīng)用

3.1 物種鑒定

在野生環(huán)境中,由于不能近距離的觀察野生動(dòng)物,許多野生動(dòng)物單從外形上很難區(qū)別開(kāi).在傳統(tǒng)的糞便學(xué)中根據(jù)糞便的大小、性狀、未消化的食物殘?jiān)鼇?lái)對(duì)物種進(jìn)行鑒定；在結(jié)合分子生物學(xué)后,可以根據(jù)微衛(wèi)星等位基因頻率的不同來(lái)區(qū)分不同的物種.利用人的微衛(wèi)星成功的對(duì)四種狒狒進(jìn)行了鑒定[24].通過(guò)糞便提取線粒體DNA,并對(duì)其細(xì)胞色素區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,根據(jù)酶切片段的比較,將分布在同一地區(qū)的紅狐,白狐,郊狼,家犬以及一種瀕危的狐貍很好的區(qū)分開(kāi)[25].用線粒體DNA細(xì)胞色素b基因特異性引物對(duì)雪豹分布區(qū)采集的109份糞便樣品進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)有31份糞便來(lái)自雪豹,其他的分別來(lái)自猞猁,赤狐,狼或狗[26].

3.2 個(gè)體識(shí)別和數(shù)量調(diào)查

目前在個(gè)體識(shí)別中用的最多的是微衛(wèi)星標(biāo)記,因?yàn)樵趥€(gè)體中微衛(wèi)星呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性,而且符合孟德?tīng)栠z傳.用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)82個(gè)海豹糞便樣品成功的進(jìn)行了個(gè)體識(shí)別[4].利用家貓的微衛(wèi)星作為引物,對(duì)雪豹糞便樣品進(jìn)行了基因型分析,成功的鑒別出了10只不同的雪豹個(gè)體[26].對(duì)廣西九重山一群白頭葉猴糞便進(jìn)行提取DNA并分型,成功的從19個(gè)糞便樣本中鑒定出14個(gè)個(gè)體[27].在傳統(tǒng)的種群數(shù)量調(diào)查中,一般是事先設(shè)定樣線或樣方,再通過(guò)目擊,足跡或糞便等計(jì)算動(dòng)物數(shù)量,并以此為基礎(chǔ),估算整個(gè)動(dòng)物分布區(qū)的動(dòng)物數(shù)量.但這種方法容易受到動(dòng)物分布的均勻程度及單個(gè)個(gè)體重復(fù)計(jì)算的影響.而利用分子糞便學(xué),我們可以通過(guò)反復(fù)搜集特定區(qū)域的糞便,進(jìn)行微衛(wèi)星或指紋圖譜分析進(jìn)行個(gè)體識(shí)別,從而估計(jì)其種群數(shù)量.

3.3 性別鑒定

在動(dòng)物的種群統(tǒng)計(jì)中,瀕危動(dòng)物性別的鑒定也是估計(jì)該瀕危動(dòng)物生存力的一個(gè)重要指標(biāo).如果雌雄嚴(yán)重失衡,終將影響該瀕危物種的繁殖力,造成嚴(yán)重的近交衰退,繼而影響其有效種群的大小,種群發(fā)展動(dòng)態(tài)及種群生存力.對(duì)于哺乳動(dòng)物而言,可以通過(guò)Y染色體上的特定基因（如SRY基因,ZFY基因）進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)擴(kuò)增的結(jié)果比較,從而鑒定出動(dòng)物的性別.利用糞便中提取的DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,成功的鑒定出兩只太陽(yáng)熊的性別為一雌一雄[15].利用分子糞便學(xué)檢測(cè)太陽(yáng)島地區(qū)灰松鼠雌雄比例為59：27[28].

3.4 親緣關(guān)系的鑒定

在瀕危動(dòng)物的保護(hù)中,了解種群的親緣關(guān)系也是不可缺少的內(nèi)容.在意大利北部的Brenta地區(qū)有一種棕熊瀕臨滅絕,為了保護(hù)該種群,擴(kuò)增其糞便中的線粒體DNA,確立了歐洲棕熊各種群之間的親緣關(guān)系,并建議引進(jìn)同Brenta親緣關(guān)系最近的Slovenia品種來(lái)恢復(fù)Brenta地區(qū)的棕熊種群[29].

3.5 父權(quán)的認(rèn)定

在動(dòng)物體內(nèi),線粒體DNA是母系遺傳的,通過(guò)線粒體DNA的基因片段,進(jìn)行序列分析,通過(guò)比較子獸和母獸以及可能父親的微衛(wèi)星DNA基因型即可進(jìn)行父權(quán)排除的鑒定,這對(duì)于更好的管理和保護(hù)瀕危野生動(dòng)物,保護(hù)它們的遺傳多樣性有著重要的意義.

3.6 食性及寄生蟲(chóng)分析

由于糞便中含有未消化的食物殘?jiān)?而且一些寄生蟲(chóng)及其卵也隨著糞便排出,所以結(jié)合分子生物學(xué),對(duì)食物和寄生生物的特定基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)定,可以使食物和病原體的檢測(cè)率大大提高,因此糞便還是了解野生動(dòng)物的食性和寄生蟲(chóng)疾病的優(yōu)良材料[30].

3.7 構(gòu)建指紋圖譜

通過(guò)對(duì)大熊貓的糞便DNA提取,并借助限制性酶切,分子雜交,同位素標(biāo)記等技術(shù)成功的構(gòu)建了大熊貓指紋圖譜,為大熊貓的保護(hù)管理計(jì)劃提供了有力的工具[31].

3.8 與GIS技術(shù)的結(jié)合

美國(guó)魚和野生生物服務(wù)中心在對(duì)紅狼（canis rufus）進(jìn)行種群恢復(fù)的過(guò)程中,由于雜合體的存在使這項(xiàng)計(jì)劃的實(shí)施受到限制,主要有2個(gè)方面的原因：一是單從形態(tài)上很難確定雜合的個(gè)體；二是需要找到郊狼(canis larans）和雜合體所生活的區(qū)域,但是此區(qū)域接近6000 km.為了解決這個(gè)問(wèn)題,通過(guò)測(cè)定糞便中的線粒體DNA并且應(yīng)用GIS技術(shù)對(duì)每個(gè)糞便樣本進(jìn)行GPS定位和標(biāo)注,從而對(duì)大范圍分布的郊狼和雜合體進(jìn)行了研究,并確定了雜合體的存在[32].

4 糞便DNA研究局限

糞便作為分子材料在研究過(guò)程中首先遇到的問(wèn)題是消化道脫落細(xì)胞量少而且在野外存在的時(shí)間一般都比較長(zhǎng),存在著一定的降解問(wèn)題；而且野外采集的糞便材料還存在著一些外源DNA的污染；糞便中有些物質(zhì)（如未消化的食物、消化酶、粘液、膽紅素等）常常影響Taq酶的活性,從而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果；另外在一些肉食動(dòng)物的糞便樣品中,還存在著其他一些動(dòng)物的殘?jiān)?這在糞便DNA的研究中就會(huì)受到很大的干擾,難以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果.在進(jìn)行棕熊的分子糞便學(xué)研究中,就發(fā)現(xiàn)僅有20%的糞便樣品可以提供足夠量的DNA用于微衛(wèi)星位點(diǎn)分析[33].

5 結(jié)束語(yǔ)

結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)興起的分子糞便學(xué),由于其非損傷性的取樣方法,試驗(yàn)材料的易獲得,并且糞便樣品的采集具有隨機(jī)性,可以顯著的增加研究對(duì)象,獲得重要的種群遺傳參數(shù).這是其他取樣方法無(wú)法做到的,因此在對(duì)于野生瀕危動(dòng)物的保護(hù)和管理具有十分重要的意義.隨著許多研究人員對(duì)分子糞便學(xué)的研究深入,對(duì)其所遇到的問(wèn)題也逐漸提出了相應(yīng)解決方法,我們有理由相信這項(xiàng)新興的技術(shù)會(huì)在生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域中煥發(fā)光彩.

[1]Mullis KB,FaloonaFA.Specific synthesis ofDNAinvitroviaapolymerase catalysedchainreaction[J].Methods Enzymol,1987,155：335-350.

[2]AlbaguhGP,IyengarV,Lohani A,et al.Isolationofexfoliatedcolonic epithelial cells,anovel,nonivasive approachtothe studyof celluarmarkers[J].International Journal ofcancer,1992,52（3）：347-350.

[3]Hoss M,KohnM,PaaboS,et al.Excermentanalysis byPCR[J].Nature,1992,359（12）：199.

[4]ReedJZ,TollitDJ,ThompsonPM,et al.The use ofmoleculargenetic analysis toassignspecies,sexandindividual identiytoseal species[J].MolecularEcology,1997,（6）：225-234.

[5]LucchiniV,FabbriE,MaruccoF,et al.Noninvasivemoleculartrackingofcolonizingwolf（canislupus）packsinthewesternItalian Alps[J].MolecularEcology,2002,11（2）：857-868.

[6]HofreiterM,Serre D,PoinarHN,et al.AncientDNA[J].Nature Reviews：Genetic,2000,（2）：353-359.

[7]Constable JJ,PackerC,Collins DA,et al.NuclearDNAfromprimate dung[J].Nature,1995，373：393.

[8]Ernest H B,Penedo MC,May B P,et al.Moleculartracking of mountain lions in the Yosemite valley region in California：genetic analysis usingmicrosatellites andfaecal DNA[J].MolecularEcology,2000,（9）：433-441.

[9]Wei F W,Rao G,Li M,et al,Molecularscatology and its application reliability,limitation and prospect[J].Acta Theriologiea Sinica,2001,21：143-152.

[10]Murphy MA,Waits LP,Kendall KC,et al.An evaluation of longtermpresevation methods forbrown bearfaecal DNA samples[J].ConservationGenetic,2002,（3）：435-440.

[11]Garnier J N,Bruford M W,Goossens B.Mating system and reproductive skew in the black rhinoceros[J].Molecular Ecology,2001,10（6）：2031-2041.

[12]Gerloff U,Hartung B,Fruth B,et al.Intra-community relationships,dispersal pattern and paternity success in a wild living community of Bonobos Pan paniscus determined from DNA analysis of faceal samples[J].Proceedings of the royal society of Londonseries B,1999,266：1189-1115.

[13]Frantz A C,PoperLC,CarpenterP J,et al.Eliable microsatellite genotyping of the Eurasian badgermeles using faecal DNA[J].MolecularEcology,2003,（12）：1649-1661.

[14]Amy D,Roeder,Frederick I,et al.A novel method for collection and preservation of faeces for genetic studies[J].Molecular Ecology,2004（4）：761-764.

[15]Wasser S K,Houston C S,Koehler G M,et al.Techniques for application of faecal DNA methods to field studies of Ursids[J].MolecularEcology,1997,（6）：1091-1097.

[16]方盛國(guó),丁朝武,馮文和,等.大熊貓DNA指紋分析材料的初步研究[J].獸類學(xué)報(bào),1997,17（6）：166-170.

[17]Frantzen M A,Silk J J B,Fergnson J W H,et al.Empircal evaluation of preservation methods for faecal DNA[J].Molecular Ecology,1998,（4）：1423-1428.

[18]Melanie A,Murphy,Lisette P,et al.An evaluation of longterm preservation methods for brown bear facal DNA samples[J].ConservationGenetics,2002,3（6）：435-440.

[19]劉艷華,張明海.馬鹿糞便樣品保存方法對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,34（2）：67-69.

[20]Piggott M P,Taylor A C.Extensive evalution of faecal preservation and DNA extraction methods in Australian native and introducedspecies[J].AustralianJournal ofZoology,2003,51：341-355.

[21]kauhala K,Rege L V.Summer food composition and food niche overlap of the raccoou dog,red fox and bager in Finland[J].Ecography,2005,21（5）：457-463.

[22]程宏毅,鮑毅新,鄭容泉,等.黑麋糞便DNA提取及其PCR檢測(cè)[J].生態(tài)科學(xué),2006,25（2）：158-161.

[23] 趙鍵元,李進(jìn)華,楊柳,等.短尾猴陳舊糞便中 DNA 提取[J].獸類學(xué)報(bào),2005,25（4）：410-413.

[24]Deuter R,Peitsch S,Hertel S,et al.A method for preparation of fecal DNA suitable for PCR[J].Nucleic Acids Res,1995,23：3800-3801.

[25]Paxingos E,Mclntosh C,Ralls K,et al.A nonivasive method for distingguish among canid species：amplication and enzyme restrictionofDNAfromdung[J].MolecularEcology,1997,（6）：483-486.

[26]張于光,JaneckaE,李迪強(qiáng),等.基于糞便DNA的雪豹種群調(diào)查和遺傳多樣性[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2008,54（5）：762-766.

[27]王躍峰,黃乘明,李友邦,等.運(yùn)用非損傷性取樣法對(duì)一群白頭葉猴的個(gè)體識(shí)別[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào),2006,（3）：83-86.

[28]張震,白秀娟.應(yīng)用分子糞便學(xué)方法調(diào)查太陽(yáng)島地區(qū)灰松鼠性別比例[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2007,11（1）：49-53.

[30]Bretagne S,Guillor J P,Morand M,et al.Detection of Echinococcus multicolaris DNA in fox fecs[J].Parasitology,1993,106：193-199.

[31]張保衛(wèi),魏輔文,李明,等.大熊貓和小熊貓糞便DNA提取的簡(jiǎn)易方法[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2004,50（3）：452-458.

[32]Adams JR,KellyBT,Waits LP.Usingfaecal DNAsamplingand GIS tomonitorhybridization between red wolves(canis rufus）andcoyotes（canis latrans）[J].MolecularEcology,2003,（12）：2175-2186.

[33]Taberlet P,Camarra J J,Griffin S,et al.Noninvasive genetic tracking of the endangered Pyrenean brown bear population[J].MolecularEcology,1997,（8）：869-876.