羧甲基絞股藍(lán)多糖的制備及其抗氧化活性研究

絞股藍(lán)(GynostemmapentaphyllumMakino)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，以全草供藥食兼用，味苦、性寒，具有清熱解毒、補氣、止咳、祛痰之功效。絞股藍(lán)多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖等多種藥理作用[1～3]。多糖分子中的取代基對多糖的活性影響很大，因而對多糖進行結(jié)構(gòu)改造有望得到活性更強、應(yīng)用范圍更廣的多糖衍生物。多糖的化學(xué)修飾方法中，羧甲基化方法因具有制備過程簡單、試劑成本低及生成物無毒性等優(yōu)點，已成為一種較常用的衍生化方法[4]。作者在此對絞股藍(lán)多糖進行羧甲基化修飾，通過紅外光譜對羧甲基絞股藍(lán)多糖(CM-GPMP)進行表征，并對其體外抗氧化活性進行研究。對研究天然產(chǎn)物中多糖及其衍生物的抗氧化活性[5]、開發(fā)天然抗氧化劑具有重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

絞股藍(lán)多糖，自制；二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，美國 Sigma 公司； 36% 鹽酸、 30% 過氧化氫、抗壞血酸、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵，西安化學(xué)試劑廠；水楊酸、冰乙酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚，天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；氯乙酸，鄭州市德眾化學(xué)試劑廠。所用試劑均為分析純。超純水用美國Milipore超純水系統(tǒng)制備。

Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；Alpha1-2型冷凍干燥機，德國Christ公司；FTIR-8400S型傅立葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA1604N型電子分析天平。

1.2 方法[6,7]

稱取絞股藍(lán)多糖100 mg懸浮于異丙醇中，攪拌1 h，加入20%NaOH溶液，室溫下劇烈攪拌，加入氯乙酸0.5 g，升溫至60℃，恒溫反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，冰乙酸調(diào)pH值為中性，超純水透析3 d，濃縮后冷凍干燥，即得羧甲基絞股藍(lán)多糖。

1.3 分析與表征

取一定量的絞股藍(lán)多糖和羧甲基絞股藍(lán)多糖用KBr壓片，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜測定。

1.4 抗氧化活性研究

1.4.1 樣品溶液的配制

將絞股藍(lán)多糖和羧甲基絞股藍(lán)多糖用雙蒸水配制成濃度(mg·mL-1)分別為0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00的樣品溶液。

1.4.2 DPPH自由基清除率測定[8,9]

配制濃度為2.0×10-4mol·L-1的DPPH無水乙醇溶液，低溫避光保存。取0.1 mL樣品溶液和0.1 mL DPPH無水乙醇溶液，混合，加入96孔板，在室溫下避光反應(yīng)30 min，然后經(jīng)多功能酶標(biāo)儀在517 nm下測定吸光值?？瞻讓φ战M以0.1 mL樣品溶劑代替樣品溶液，每個濃度均做3個復(fù)孔,取其平均值，以VC作陽性對照，臨用前以雙蒸水配制。

1.4.3 羥基自由基清除率測定[9～11]

在96孔板中加入9 mmol·L-1FeSO4水溶液、9 mmol·L-1水楊酸無水乙醇溶液各0.067 mL、樣品溶液0.1 mL，最后加入0.067 mL 9 mmol·L-1H2O2啟動反應(yīng)，室溫避光反應(yīng)30 min。于510 nm下測定吸光值?？瞻讓φ战M以0.1 mL樣品溶劑代替樣品溶液，每個濃度均做3個復(fù)孔，取其平均值，以VC作陽性對照，臨用前以雙蒸水配制。

1.4.4 超氧陰離子自由基清除率測定[9～11]

在96孔板中依次加入0.090 mL pH值8.2的Tris-HCl緩沖溶液、0.1 mL樣品溶液、0.01 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，室溫避光反應(yīng)5 min，加入0.1 mL 8 mmol·L-1HCl終止反應(yīng)，于320 nm下測定吸光值?？瞻讓φ战M以0.1 mL樣品溶劑代替樣品溶液，每個濃度均做3個復(fù)孔，取其平均值，以VC作陽性對照，臨用前以雙蒸水配制。

1.4.5 自由基清除率的計算

自由基清除率依下式計算：

式中:A0為空白的平均吸光度；A1為樣品的平均吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

絞股藍(lán)多糖和羧甲基絞股藍(lán)多糖的紅外光譜見圖1。

圖1 GPMP(a)和CM-GPMP(b)的紅外光譜

由圖1可見，絞股藍(lán)多糖經(jīng)羧甲基化后，878.26 cm-1處的葡萄糖特征吸收峰減弱，1597.50 cm-1處出現(xiàn)了較強的COO-特征吸收峰，1424.05 cm-1處出現(xiàn)了與羧基相連的次甲基的剪式振動吸收峰,表明絞股藍(lán)多糖已成功羧甲基化。

2.2 對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在517 nm處有一強吸收峰，抗氧化劑可與其單電子配對而使其吸收逐漸消失。GPMP、CM-GPMP和VC對DPPH自由基的清除作用如圖2所示。

圖2 VC、GPMP和CM-GPMP對DPPH自由基的清除作用

由圖2可見，VC清除DPPH自由基能力非常強，濃度為0.1 mg·mL-1時的清除率高達93.67%；而GPMP和CM-GPMP對DPPH自由基的清除能力相當(dāng)，均不及VC。隨著多糖濃度增大，CM-GPMP和GPMP清除DPPH自由基能力有所增強。當(dāng)濃度為0.5 mg·mL-1時，CM-GPMP和GPMP的清除率分別為20.82%和19.39%;而當(dāng)濃度升至2.0 mg·mL-1時，CM-GPMP和GPMP的清除率分別為25.71%和23.27%。由此可見，CM-GPMP和GPMP在較低濃度時對DPPH自由基均具有一定的清除能力，增加濃度,其清除能力增強不明顯。

2.3 對羥基自由基的清除作用

GPMP、CM-GPMP和VC對·OH的清除作用如圖3所示。

圖3 VC、GPMP和CM-GPMP對·OH的清除作用

由圖3可見，在所測試的濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度增大，CM-GPMP和GPMP清除·OH的能力逐漸增強，呈一定的量效關(guān)系。濃度為2.0 mg·mL-1時，GPMP、CM-GPMP對·OH的清除率分別為84.93%、67.30%,不及VC(98.63%)。羧甲基化修飾后，GPMP對·OH的清除能力有所降低，可能是由于多糖修飾后羥基數(shù)目減少的緣故。GPMP對·OH的清除能力非常強，呈一定的量效關(guān)系，表明GPMP在清除羥基自由基方面具有極大的潛力。

2.4 對超氧陰離子自由基的清除作用

圖4 VC、GPMP和CM-GPMP對的清除作用

3 結(jié)論

采用溶媒法制備了羧甲基絞股藍(lán)多糖，紅外光譜分析表明多糖羧甲基化修飾成功。CM-GPMP和GPMP對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，濃度為2.0 mg·mL-1時，CM-GPMP對上述三種自由基的清除率分別為25.71%、67.30%、29.95%，而GPMP對三種自由基的清除率分別為23.27%、84.93%、15.24%。絞股藍(lán)多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，其清除超氧陰離子自由基的能力有所提高，清除羥基自由基的能力下降，而清除DPPH自由基的能力變化不大。表明絞股藍(lán)多糖可潛在地用于抗氧化劑的開發(fā)，羧甲基化修飾對絞股藍(lán)多糖的體外抗氧化活性有一定的影響，可通過對絞股藍(lán)多糖進行化學(xué)修飾改善其抗氧化活性。

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