鄰苯二甲酸酯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的聯(lián)合毒性*

何秀婷，李 瀟，楊永濤，2，李凱彬，李桂英，聶湘平

(1．暨南大學(xué)水生生物研究所，廣東 廣州 510632；2.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東 曲阜 273155；3．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；4．中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所，廣東 廣州 510640)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)是一類應(yīng)用廣泛的人工合成工業(yè)有機(jī)化合物質(zhì)，主要用作為增塑劑，以提高產(chǎn)品的可塑性和強(qiáng)度，也普遍用于農(nóng)藥、涂料、印染、油漆、化妝品、香料和生活用品的生產(chǎn)。由于PAEs極易遷移進(jìn)入環(huán)境，且難以降解，隨著塑料橡膠制品的廣泛應(yīng)用，在大氣、水體、土壤、生物體乃至人體都發(fā)現(xiàn)PAEs的存在[1-2]。研究表明PAEs類化合物具有雌激素作用，能夠干擾人體內(nèi)正常的內(nèi)分泌從而影響生殖[3-4]；也有研究報(bào)道該類化合物存在致癌 、致畸、致突變和致哮喘的作用[5-6]。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(US EPA)將鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate, DMP), 鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate, DEP), 鄰苯二甲酸二正丁酯(Dibutyl phthalate, DBP), 鄰苯二甲酸丁基芐基酯(Butylbenzyl phthalate, BBP), 鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate, DOP), 鄰苯二甲酸二異辛酯(Di-(2-etylhexyl) phthalate, DEHP) 6種 PAEs化合物列為優(yōu)先控制的有毒污染物[7]，我國(guó)也將DEP、DMP和 DOP 3種PAEs化合物確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[8]。目前，對(duì)鄰苯二甲酸酯類化合物的研究主要集中在單一污染物的毒性效應(yīng)。而實(shí)際上這幾種化合物常常是同時(shí)存在于環(huán)境中，生物體更多是處在這些化合物的混合暴露中。本研究以斑馬魚為模式生物，選擇了4種養(yǎng)殖魚體內(nèi)被普遍檢出的鄰苯二甲酸酯類化合物[9]，即DMP、DEP、DBP和DEHP，探討它們?cè)诎唏R魚胚胎發(fā)育過(guò)程的單一毒性和聯(lián)合毒性效應(yīng)，為這類物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)管理提供有效的毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)選用以4種鄰苯二甲酸酯類：DMP、DEP、DBP和DEHP，均為分析純，購(gòu)于美國(guó)Accu Standard，INC。助溶劑丙酮為國(guó)產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)儀器包括; 倒置光學(xué)顯微鏡、可控光、控溫循環(huán)水族箱、光照恒溫培養(yǎng)箱和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將成年斑馬魚(雌雄魚數(shù)量比約為2∶1)斑馬魚飼養(yǎng)在經(jīng)活性炭過(guò)濾并充分曝氣的水體內(nèi)，水體pH 8.34，總硬度為28～32 dH，保持(26±1)℃，光照/黑暗周期14 h/10 h，進(jìn)行馴養(yǎng)。每日喂食2次經(jīng)紫外消毒處理過(guò)的冷凍魚食搖蚊幼蟲(來(lái)自非污染環(huán)境，經(jīng)檢測(cè)四種受試化合物的含量低于檢測(cè)限)。 根據(jù)Nagel法收集受精卵[10]。 魚卵收集后，用水迅速清洗除去殘留物，在倒置顯微鏡下挑選出分裂正常的受精卵，進(jìn)行毒性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水是曝氣24 h以上的自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(0.1%丙酮)及處理組各設(shè)置三個(gè)平行。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單一毒性實(shí)驗(yàn) 按照OECD[11]指南設(shè)計(jì)胚胎毒性試驗(yàn)。測(cè)試化合物的丙酮儲(chǔ)備液用純凈水配制成水溶液，母液中的丙酮體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.3%，受試液中丙酮的體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.1%。開始實(shí)驗(yàn)前，分別配制4種PAEs 的5組質(zhì)量濃度(DMP: 2.50, 5.00, 10.0, 20.0, 40.0 mg/L； DEP: 0.75, 1.50, 3.00, 6.00, 12.0 mg/L； DBP: 0.075, 0.15, 0.30, 0.60, 1.20 mg/L；DEHP: 0.250, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00 mg/L)備用。選用24孔多孔板，每孔的容積為3 mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加入2 mL試液，放一枚受精卵。每張多孔板為一個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組(φ=0.1%丙酮)。鋁箔封面以避免蒸發(fā)改變實(shí)驗(yàn)濃度。將密封好的多孔板放在溫度恒定為(26±1)℃的光照培養(yǎng)箱中孵化。在倒置顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，記錄發(fā)育過(guò)程中一些具有代表性的毒理學(xué)終點(diǎn)[12]，并記錄48 h胚胎死亡數(shù)，用概率單位法計(jì)算48 h LC50值。

1.3.2 聯(lián)合毒性試驗(yàn) 在已測(cè)得48 h半數(shù)死亡質(zhì)量濃度(LC50)的基礎(chǔ)上，每種化合物設(shè)定高、中、低3個(gè)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度(見表1)，考慮到各因素之間可能存在的聯(lián)合交互作用，采用四因素三水平L27(313)正交表把試驗(yàn)分為27組，每組設(shè)3個(gè)平行，測(cè)試各混合物對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)，并記錄各試驗(yàn)組48 h的胚胎死亡數(shù)、孵化數(shù)和畸形數(shù)。

表1 4種鄰苯二甲酸酯混合暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響的正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)處理

單一毒性試驗(yàn)根據(jù)胚胎48 h的死亡數(shù)，用概率單位法計(jì)算48 h半致死質(zhì)量濃度(LC50-48)。聯(lián)合毒性試驗(yàn)中考慮4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中單因素和兩兩交互作用對(duì)斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng)大小的影響，結(jié)果以平均死亡率、平均孵化率和平均致畸率表示。數(shù)據(jù)采用極差分析法篩選出對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性、發(fā)育毒性和致畸毒性影響最大的水平組合。極差越大，代表4種PAEs的聯(lián)合作用時(shí)該因素對(duì)斑馬魚胚胎毒性的影響越大；極差越小，代表4種PAEs的聯(lián)合作用時(shí)該因素對(duì)斑馬魚胚胎的毒性的影響越小。

2 結(jié) 果

2.1 單一毒性試驗(yàn)

根據(jù)各組48 h死亡率，以概率單位計(jì)算LC50值，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對(duì)暴露在鄰苯二甲酸酯類溶液里的斑馬魚胚胎進(jìn)行觀察可以發(fā)現(xiàn)：暴露4 h后觀察，部分胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，原本應(yīng)該光滑的胚胎細(xì)胞表面出現(xiàn)了一些包狀突起(見圖1：d)，且多見于動(dòng)物極，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，包狀突起逐漸變大，導(dǎo)致出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象(見圖1：e、f)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(一般不超過(guò)延長(zhǎng)期)后導(dǎo)致卵凝結(jié)(見圖1：g)。

圖1 PAEs暴露下斑馬魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期形態(tài)變化圖

暴露8 h后觀察，進(jìn)入原腸胚期的胚胎細(xì)胞有部分出現(xiàn)卵黃囊分裂異常，形成卵黃外突，也會(huì)出現(xiàn)胚胎細(xì)胞的自溶現(xiàn)象(見圖1：j、k、l)，導(dǎo)致卵凝結(jié)。原腸胚期胚層運(yùn)動(dòng)的方式是外包，胚胎因外包功能的缺失而妨礙前后體軸的形成，而導(dǎo)致了以上異常的產(chǎn)生[13]。

暴露12 h后觀察，胚胎處于分裂期，肌節(jié)開始形成(見圖1：m)，為器官形成的初級(jí)階段，暴露后的胚胎可能會(huì)出現(xiàn)尾部畸變和卵黃囊異常(見圖1：o)。

暴露24 h和48 h后觀察，由于這個(gè)時(shí)期的胚胎處在成形期和孵化期，尾部已經(jīng)與卵黃囊分離，且色素沉積較多(見圖1：n)，很容易觀察到形體、心臟和血液循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育，可發(fā)現(xiàn)有部分胚胎出現(xiàn)心包腫大、心率緩慢、脊椎和尾部彎曲，色素沉積減少等現(xiàn)象(見圖1：p)。

表2 四種鄰苯二甲酸酯類對(duì)斑馬魚胚胎的48 h LC50值

2.2 聯(lián)合毒性試驗(yàn)

4種鄰苯二甲酸酯混合暴露時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎死亡率、孵化率和致畸率的影響正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，正交試驗(yàn)極差分析見圖2。

圖2 4種PAEs混合暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育正交試驗(yàn)的死亡率、孵化率和致畸率的極差分析

2.2.1 PAEs混合暴露對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中DEP對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響最大,其次是DMP,最小的是DEHP。但通過(guò)正交試驗(yàn)分析，混合暴露中DBP與DEHP的交互作用對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性的影響最大。其次為DBP和DEP以及DMP和DEHP的交互作用。當(dāng)DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.10, 2.50, 0.20和0.80 mg/L的質(zhì)量濃度混合暴露時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響最大。

2.2.2 PAEs混合暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中，DEP和DMP對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響較大，DEHP對(duì)胚胎死亡率的影響最小。正交試驗(yàn)分析表明DBP和DEHP的交互作用對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響最大,其次是DEP和DBP交互作用以及DMP與DEHP的交互作用。當(dāng)DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.10, 2.50, 0.01, 0.40 mg/L的質(zhì)量濃度混合暴露時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性影響最大。

2.2.3 PAEs混合暴露對(duì)斑馬魚致畸毒性影響 在4種鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中DBP對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響最大,其次是DMP,最小的是DEP。而4種鄰苯二甲酸酯交互作用對(duì)胚胎孵化率的影響不大。當(dāng)DEP、DMP、DBP和DEHP分別以0.90, 5.00, 0.20和 0.40 mg/L的質(zhì)量濃度混合時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎的致畸毒性影響最大。

3 討 論

根據(jù)48 h半致死質(zhì)量濃度，4種鄰苯二甲酸酯類化合物對(duì)斑馬魚胚胎的毒性大小依次為DBP>DEHP>DEP>>DMP，不同種類PAEs的毒性效應(yīng)各有不同，這可能這與鄰苯二甲酸酯鏈上的碳鏈長(zhǎng)度有關(guān)，碳鏈越長(zhǎng)相對(duì)脂溶性越強(qiáng)，對(duì)斑馬魚胚胎的毒性越大。有文獻(xiàn)報(bào)道4種鄰苯二甲酸酯類化合物對(duì)綠藻Selenastrumcapricornutum的毒性大小為DEHP>DBP>DEP>DMP[14]。Naoki等研究了蝦(Brine Shrimp)卵分別在DMP、DEP和DBP的溶液中孵化，結(jié)果表明3種PAEs的毒性大小為DBP>DEP>DMP[15]；與本研究的結(jié)果有相似之處。Yang等[16]和Liu等[17]分別對(duì)鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)的胚胎進(jìn)行酞酸酯類化合物毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上述4種PAEs的毒性大小依次為DBP>DMP>DEP>DEHP，有研究認(rèn)為由于DEHP側(cè)鏈較長(zhǎng)，有較高的脂溶性，使其難于滲透到胚胎細(xì)胞中，因此表現(xiàn)出比其它3種PAEs毒性低[18]。高質(zhì)量濃度(大于或等于半致死質(zhì)量濃度)的PAEs會(huì)造成斑馬魚胚胎在短時(shí)間內(nèi)就凝結(jié)死亡；而較高的濃度(在不致死的情況下)會(huì)導(dǎo)致胚胎同時(shí)出現(xiàn)發(fā)育阻滯、色素沉積減少、心包水腫并伴有心率減慢、脊椎和尾部畸形、卵黃囊異常等毒性指標(biāo)的4種以上；暴露在較低質(zhì)量濃度(小于半致死質(zhì)量濃度)PAEs下的斑馬魚的胚胎只會(huì)出現(xiàn)以上毒性指標(biāo)的一種或同時(shí)出現(xiàn)兩種，一般多表現(xiàn)為為脊椎和尾部彎曲。

表3 4種鄰苯二甲酸酯混合暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響的正交試驗(yàn)及其結(jié)果1)

1) m1：水平1平均值；m2：水平2平均值；m3：水平3平均值。

在混合暴露中，4種鄰苯二甲酸酯類化合物對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響相似,影響程度的大小依次為DEP>DMP>DBP>DEHP,結(jié)果不同于單一毒性試驗(yàn), 這可能是由于混合暴露中各化合物之間存在協(xié)同或者拮抗的效應(yīng)。

DBP和DEHP在混合暴露中的交互作用對(duì)斑馬魚胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性的影響相對(duì)較大，二者間可能發(fā)生協(xié)同作用導(dǎo)致毒性加強(qiáng)；同樣DBP和DEP、DMP和DEHP間也會(huì)發(fā)生協(xié)同作用。

DMP和DBP交互作用時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性的影響與DMP單因素的影響程度是相似，而對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的影響則比DMP單因素的影響都強(qiáng), 說(shuō)明二者交互作用時(shí)，DMP對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性的影響起主導(dǎo)作用，但對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性DBP和DMP表現(xiàn)為協(xié)同作用。

DEP對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響比其它3種鄰苯二甲酸酯的影響要大，當(dāng)DEP分別和DMP、DEHP、DBP交互時(shí)，DEP對(duì)聯(lián)合毒性的影響起主導(dǎo)作用，只有當(dāng)DEP和DBP交互作用時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響會(huì)加強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用；而當(dāng)DEP與DMP交互時(shí)，對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性的影響比二者單因素的影響都要小，說(shuō)明DEP和DMP之間存在拮抗作用。

當(dāng)DEHP與其他幾種PAEs交互作用時(shí)，往往會(huì)使其毒性變大。

4種鄰苯二甲酸酯類化合物聯(lián)合作用對(duì)斑馬魚胚胎致畸毒性的影響結(jié)果不同于對(duì)其致死毒性和發(fā)育毒性的影響。DBP和 DMP在混合暴露中對(duì)斑馬魚胚胎致畸毒性的影響都很大，而正交分析表明二者交互時(shí)其影響程度降低，DBP和DMP對(duì)胚胎致畸毒性表現(xiàn)為拮抗作用； DMP和 DEHP交互作用的情況與 DBP和 DMP交互作用的情況相同，二者之間也出現(xiàn)拮抗作用；相反， DEP和DEHP對(duì)斑馬魚胚胎混合暴露致畸毒性的影響相對(duì)比較小，但正交分析DEP和DEHP交互作用對(duì)胚胎致畸毒性的影響程度顯著升高，說(shuō)明二者之間存在協(xié)同作用。

在鄰苯二甲酸酯類化合物混合暴露中，4種不同的化合物酯對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性、胚胎發(fā)育毒性和胚胎致畸毒性過(guò)程中會(huì)表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗不同作用的影響，其確切機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。復(fù)合污染物暴露產(chǎn)生的毒性效應(yīng)較單一的污染物復(fù)雜，它們的毒性效應(yīng)與介質(zhì)及不同污染物的組合關(guān)系、污染物的濃度、暴露的對(duì)象和暴露方式等因素密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

1)DMP、DEP、DBP和DEHP對(duì)斑馬魚胚胎的48 h LC50值分別為5.06、0.89、0.20和0.77 mg/L，毒性大小依次為DBP、DEHP、DEP、DMP。

2)在所設(shè)計(jì)的四因素三水平正交試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，4種PAEs混合暴露過(guò)程中，DBP和DEHP交互作用對(duì)斑馬魚胚胎致死毒性和發(fā)育毒性影響最大，而DEHP影響卻是最小。DBP對(duì)斑馬魚胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性的影響相對(duì)較小，但對(duì)斑馬魚胚胎的致畸毒性的影響很大，在混合暴露中DBP就會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育的嚴(yán)重畸形。而DMP和DEHP交互作用的影響最小。

參考文獻(xiàn)：

[1] MARIKO M, MUTSUKO H K, MAKOTO E. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2008,50:37-49.

[2] HUANG Pochin, TIEN Cheinjung, SUN Yihmin, et al. Occurrence of phthalates in sediment and biota: Relationship to aquatic factors and the biota-sediment accumulation factor[J].Chemosphere,2008,73:539-544.

[3] HARRISSON P T C, HOLMES P, HUMIREY C D N. Reproductive health in humans and wildlife: are adverse trend associated with environmental chemical exposure[J].The Science of the Total Environment,1997,205:97-106.

[4] LATINI G. Monitoring phthalate exposure in humans[J].Clinica Chimica Acta,2005,361:20-29.

[5] SCOTTA. Industry slams its own study after it links asthma to phthalates[J].Chemical Week,2004,106(28):13.

[6] 王蕊,李厚勇,王子蘭,等.鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯致畸致突變實(shí)驗(yàn)研究[J].癌變·畸變·突變,2002,14(2):120-121.

[7] 周文敏.環(huán)境優(yōu)先污染物[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,1989:11-13.

[8] 金相燦.有機(jī)化合物污染化學(xué)-有毒有機(jī)物污染化學(xué)[M].北京:清華大學(xué)出版社,1990:266-275.

[9] 李瀟,聶湘平,潘德博,等.養(yǎng)殖魚體鄰苯二甲酸酯含量與分布特征[J].環(huán)境與健康雜志,2008,25(3):202-204.

[10] SCHULTE C, NAGEL R. Test Acute Toxicity in the Embryo of Zebrafish,Brachydanio rerio,as an Alternative to the Acute Fish Test: Preliminary Results[J].Alternatives to Laboratory Animals,1994,22:12-19.

[11] OECD(Organization for Economic Cooperation and Development). OECD TG212 Fish,short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages[S].Paris France:Europe Committee,1998:208-209.

[12] 周宇,于紅霞,丁翔,等.氯代苯類有機(jī)污染物對(duì)斑馬魚胚胎聯(lián)合毒性效應(yīng)的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(3):340-344.

[13] AXEL O. The Use of a Refined Zebrafish Embryo Bioassay for the Assessment of Aquatic Toxicity[J].Research Note,2000,29(7):32-40.

[14] ADAMS W J, BIDDINGER G. R, ROBILLARD K A. A summary of the acute toxicity of 14 phthalate esters to representative aquatic organism[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1995,14(9):1569-1574.

[15] NAOKI S. Toxic effect of a normal series of phthalate esters on the hatching of shrimp eggs[J].Toxicology and Applied Pharmacology,1974,30(1):87-89.

[16] YANG Zhihui, ZHANG Xiangjing, CAI Zhonghua. Toxic effect of several phthalate esters on the embryos and larvae of abaloneHaliotisdiversicolorsupertexta[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2009,27(2):395-399.

[17] LIU Ying, GUAN Yuntao, YANG Zhihui, et al. Toxicity of seven phthalate esters to embryonic development of the abaloneHaliotisdiversicolorsupertexta[J].Ecotoxicology,2009,18:293-303.

[18] STAPLES C A, ASAMS W J, PARKERTON J W, et al. Aquatic toxicity of eighteen phthalate esters[J].Environmental Toxicology and Chemistry,1997,16(5):875-891.