自骨密質(zhì)中分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

邊素艷 蓋魯粵 葉 平 郭子寬 王 華 王立生

·論著·

自骨密質(zhì)中分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

邊素艷 蓋魯粵 葉 平 郭子寬 王 華 王立生

目的介紹一種自Wistar大鼠骨密質(zhì)中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）的方法。方法應(yīng)用骨髓密度梯度離心、酶消化骨密質(zhì)兩種方法分離、培養(yǎng)Wistar大鼠MSC，比較其形態(tài)學(xué)、體外增殖能力差異；并用堿性磷酸酶染色和油紅O染色分別鑒定MSC的成骨和成脂分化潛能。結(jié)果采用密度梯度離心骨髓或用酶消化后的骨密質(zhì)，經(jīng)貼壁培養(yǎng)后均能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSC，兩者在形態(tài)學(xué)和體外增殖能力方面無(wú)明顯差異；且兩種方法培養(yǎng)的MSC經(jīng)特異性誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，均可向脂肪及成骨細(xì)胞分化，油紅O染色及堿性磷酸酶染色均陽(yáng)性。結(jié)論自骨髓和骨密質(zhì)中均能夠分離培養(yǎng)出較為純化的大鼠MSC，兩種方法培養(yǎng)的MSC體外生物學(xué)性能無(wú)明顯差異。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨密質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一種成體干細(xì)胞，能在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化成骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)等組織，且易于獲得，體外分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便，無(wú)免疫排斥及倫理問題，目前已成為細(xì)胞治療及組織工程的理想種子細(xì)胞[1]。但MSC在骨髓中含量較少，體外擴(kuò)增能力有限[1]。因此，建立有效的MSC體外分離、擴(kuò)增、純化及鑒定體系是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)，自小鼠骨密質(zhì)中可成功分離培養(yǎng)MSC，解決了自骨髓中獲取MSC的困難。大鼠是實(shí)驗(yàn)研究中常用的模型動(dòng)物，鼠齡越小，體外培養(yǎng)的MSC增殖能力越強(qiáng)，但幼鼠骨髓量少，如果能從大鼠骨密質(zhì)中分離培養(yǎng)出MSC，且驗(yàn)證它們的生物學(xué)性能與骨髓中培養(yǎng)的不存在明顯差異，那么將為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增MSC提供另外一條可能的途徑，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，本研究擬通過體外研究對(duì)這些問題進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2周齡雌性Wistar大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。試劑α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)），特級(jí)篩選胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），胎牛血清（北京元亨生物公司），胰酶（Amresco公司，美國(guó)），Percoll(Pharmacia公司，美國(guó)，比重為1.073 g/L)，Ⅱ型膠原酶消化液（Sigma公司，美國(guó)，用α-MEM培養(yǎng)基配制，終濃度0.2%），地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤和消炎痛（Sigma公司，美國(guó)），β-甘油磷酸鈉鹽和維生素C鈉鹽（Fluka公司），磷酸對(duì)硝基苯酚二鈉鹽（Amresco公司，美國(guó)），BCIP/NBT堿磷酶染色試劑盒（北京中杉金橋生物公司），油紅O染料（北京化工廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

CO2氣體恒溫培養(yǎng)箱（Thermo electron公司，美國(guó)），超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本)，R450型酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 MSC的分離和培養(yǎng)

骨髓分離培養(yǎng)法：取2周齡的雌性Wistar大鼠2只，斷頸處死后以75%乙醇浸泡5 min，移入超凈工作臺(tái)，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，剪去骨骺端，用含10%血清的α-MEM培養(yǎng)基沖出骨髓，離心并棄脂肪層，所獲細(xì)胞重新用5 mL上述培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，并小心加入含5 mL Percoll分離液（1.073 g/L）的離心管內(nèi)，保持界面清晰，1 500 r/min離心20 min，小心吸取約1 mL界面細(xì)胞層至另一離心管中，用上述培養(yǎng)基重新制成細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心8 min，反復(fù)2次，以洗凈細(xì)胞懸液中的Percoll，用含10%篩選胎牛血清或普通胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基（含有100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）重懸并計(jì)數(shù)細(xì)胞，以每孔2×106個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中，37℃、飽和濕度、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后全量換液，棄未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次，并用倒置顯微鏡觀察拍照。

骨片培養(yǎng)法：取2周齡的雌性Wistar大鼠2只，用上述方法分離雙側(cè)股骨和脛骨，去除骨骺端，用眼科剪剪碎成1 mm3骨片，用0.2%（1 mg/mL）Ⅱ型膠原酶37℃、200 r/min振搖消化1 h，棄消化上清，用α-MEM沖洗骨片3遍，用含10%篩選胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后換液，倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

兩種方法均待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，以0.05%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并按1∶3的比例傳代，對(duì)MSC進(jìn)行增殖與純化。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將兩種方法獲得的第3代MSC按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種5個(gè)復(fù)孔，從接種后第1～5天以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。具體步驟：每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，37℃培養(yǎng)4 h，吸棄上清后每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min溶解結(jié)晶，酶聯(lián)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光吸收值（OD），并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 脂肪和成骨分化誘導(dǎo)[2]及檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSC接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔5 000個(gè)）。貼壁培養(yǎng)24 h后，非誘導(dǎo)組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組應(yīng)用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液（地塞米松1 μmol/L+異丁基甲基黃嘌呤0.5 mmol/L +消炎痛100 μmol/L）或成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（地塞米松100 nmol/L+β-甘油磷酸鈉鹽10 mmol/L+維生素C鈉鹽0.05 mmol/L）進(jìn)行脂肪或成骨分化誘導(dǎo)，每3天換液，第8天通過油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)沉積，第14天應(yīng)用BCIP/NBT染色試劑盒進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以STATA 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MSC的形態(tài)學(xué)觀察

分離骨髓培養(yǎng)的原代MSC，鏡下觀察有大量紅細(xì)胞和有核細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中（圖1A）；48 h后換液棄去未貼壁的造血細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為MSC，形態(tài)多樣，呈梭形、多角形和三角形等；72 h后可見漩渦狀或輻射狀排列的梭形和三角形細(xì)胞集落式生長(zhǎng)；第7～10天，細(xì)胞增殖迅速，集落中細(xì)胞數(shù)量增多，呈融合生長(zhǎng)，此時(shí)可行傳代培養(yǎng)（圖1B）。

應(yīng)用骨片培養(yǎng)的MSC，48 h后可見較多梭形或三角形貼壁細(xì)胞自骨片周圍爬出（圖1C）；2～5 d后以骨片為中心可見細(xì)胞呈放射狀集落式生長(zhǎng)（圖1D）；當(dāng)細(xì)胞成融合生長(zhǎng)時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

骨片培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯較骨髓分離培養(yǎng)多，易于形成集落。兩種方法傳代后的MSC形態(tài)無(wú)明顯差異，均呈梭形、三角形、多邊形，有長(zhǎng)突起，核橢圓形，生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異。10代以前，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，增殖迅速，均2～4 d傳代1次。

圖1 大鼠骨髓MSC的形態(tài)學(xué)觀察

2.2 生長(zhǎng)曲線

兩種方法擴(kuò)增培養(yǎng)的第3代MSC生長(zhǎng)曲線相似（圖2）。傳代培養(yǎng)1～2 d時(shí)，吸光度變化不大，細(xì)胞處于潛伏期；第2～3天時(shí)，細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)并達(dá)高峰；之后，細(xì)胞生長(zhǎng)均進(jìn)入平臺(tái)期。

圖2 兩種方法獲得的MSC生長(zhǎng)曲線相似

2.3 MSC體外脂肪和成骨分化潛能分析

成脂誘導(dǎo)第8天，細(xì)胞形態(tài)改變，胞內(nèi)布滿圓形透亮脂質(zhì)空泡，油紅O染色可見脂滴均呈紅色深染，說明有大量脂肪細(xì)胞生成（圖3）。成骨誘導(dǎo)第14天，形成大量扁平狀成骨細(xì)胞，ALP染色陽(yáng)性。兩種方法培養(yǎng)的MSC，在成脂和成骨分化能力上無(wú)明顯差異。

圖3 大鼠MSC體外脂肪和成骨分化（200×）

3 討論

MSC數(shù)量較為稀少，成人骨髓中的有核細(xì)胞含量平均約1/100 000[1]。因此，探索適宜MSC分離、擴(kuò)增的方法，對(duì)進(jìn)一步研究MSC生物學(xué)特性和誘導(dǎo)分化極其重要。

目前，貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法是較為常用的兩種MSC的分離培養(yǎng)方法[3-4]。貼壁法簡(jiǎn)單，但所獲細(xì)胞種類復(fù)雜，包含有紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞等多種細(xì)胞，不能滿足細(xì)胞工程對(duì)種子細(xì)胞的純度要求。應(yīng)用密度為1.073 g/mL的Percoll分離液，通過密度梯度離心法，可成功分離出高純度的骨髓MSC，雜質(zhì)細(xì)胞少，細(xì)胞活力相對(duì)較強(qiáng)，并能穩(wěn)定傳代且保持其多向分化潛能的特性。密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合的方法，是目前普遍采用的實(shí)驗(yàn)研究或臨床應(yīng)用的培養(yǎng)方法，是根據(jù)密度差別，經(jīng)梯度離心后，有效去除絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板和脂肪細(xì)胞，獲得較高純度的單個(gè)核細(xì)胞群，然后根據(jù)MSC與造血細(xì)胞、少量單核-巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞貼壁性能差別，通過換液、對(duì)胰蛋白酶消化反應(yīng)的不同以及傳代等方法，可純化MSC。該方法適用于大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究或臨床應(yīng)用。而對(duì)于小動(dòng)物，如小鼠或大鼠，由于其骨髓含量少，經(jīng)密度梯度離心后獲得的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)目更少，體外分離培養(yǎng)較為困難，故尋求一種簡(jiǎn)便的方法是實(shí)驗(yàn)研究的需要，也可為尋求干細(xì)胞的獲得新的途徑。

郭子寬等[5]以骨片培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)骨密質(zhì)中同樣存在廣泛的MSC，分離培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)鑒定為MSC。本研究將其用于分離培養(yǎng)大鼠MSC，發(fā)現(xiàn)此法操作簡(jiǎn)單，骨髓細(xì)胞貼壁率高，細(xì)胞形態(tài)單一，較易形成集落，傳代培養(yǎng)后在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式以及體外多向分化潛能上與骨髓法培養(yǎng)法無(wú)異，但此法僅適用于較小鼠齡（0～2周）的小鼠或大鼠。需要注意的是，在分離股骨或脛骨時(shí)，必須將骨骼肌分離徹底，否則易受骨骼肌細(xì)胞污染。

許多細(xì)胞的增殖能力在發(fā)育的不同階段明顯不同。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，MSC的數(shù)量隨年齡增加而逐漸減少，增殖活性隨年齡增加而逐漸減低[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，鼠齡越小，分離培養(yǎng)的MSC集落形成率、增殖能力越強(qiáng)。2周齡以上的大鼠均易于獲得骨髓，但鼠齡越小分離的MSC體外增殖能力越強(qiáng)。而骨片培養(yǎng)法則適用于乳鼠或4周齡以下幼鼠，但乳鼠股骨分離難度較大，4周齡以上者骨質(zhì)較硬，不易操作，以2周齡大鼠為宜，且獲得的MSC體外擴(kuò)增能力較強(qiáng)。傳代培養(yǎng)繪制生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，自2周齡幼鼠骨髓或骨片分離培養(yǎng)的第3代MSC，體外增殖能力無(wú)明顯差異。

因MSC缺乏特異的細(xì)胞表面標(biāo)志，尚無(wú)直接方法可鑒定得到MSC。目前MSC鑒定的方法大多是通過排除法，排除CD34（造血干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志）、CD11a（淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志）和CD45（白細(xì)胞表面標(biāo)志）等表達(dá)，然后逆推得知其是否為MSC[7]。因成骨、成脂分化潛能是MSC的基本生物學(xué)特性之一，故用成脂和成骨分化潛能可間接證實(shí)MSC的性質(zhì)，這種方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單實(shí)用，適合作為MSC的鑒定方法。本研究通過體外誘導(dǎo)MSC向脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化來(lái)鑒定MSC的多向分化潛能，間接證實(shí)我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞具備MSC的特性，且同時(shí)證實(shí)兩種不同方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞在分化潛能上無(wú)差異。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分別采用骨髓Percoll密度梯度離心和酶消化骨片加貼壁篩選法，均成功分離培養(yǎng)并擴(kuò)增了大鼠MSC，自骨片（骨密質(zhì)）中可獲得高純度、具備多向分化潛能的MSC，體外生物學(xué)特性與骨髓分離者無(wú)顯著差異。

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Isolation and Culture-Expansion of Rat Compact Bone-Derived Mesenchymal Stem Cells

BIAN Suyan1,GAI Luyue1,YE Ping1,GUO Zikuan2,WANG Hua2,WANG Lisheng2.1 General Hospital of PLA,Beijing 100853,China;2 Department of Experimental hematology,Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China.Corresponding author:WANG Lisheng.

ObjectiveTo introduce a detailed protocol for isolating and expanding mesenchymal stem cells(MSC)from Wistar rat compact bones.MethodsWistar′s MSC were isolated and culture-expanded from bone marrow by Percoll density gradient centrifugation or from compact bone debris by digestion with collagenase type II.The morphological and proliferation features between the two populations of MSC were compared.The in vitro osteogenesis and adipogenesis were identified by intracellular alkaline phosphatase activity and droplets of lipids respectively.ResultsMSC were successfully isolated and culture-expanded by two different methods.Both of these two populations took fibroblast-like morphology and exhibited similar proliferative activity.They could be induced into adipocytes and osteoblasts in vitro under the defined conditions,which were revealed by positive Oil-Red O and alkaline phosphatase staining.ConclusionBoth bone marrow and compact bones could be served as the sources for isolating rat MSC,and the biological properties of the harvested cells are comparable.

Rat;Mesenchymal stem cells;Compact bone-derived;Cell culture

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）01－0001－04

2009年11月6日；

2010年1月28日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.001

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30871018）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（863項(xiàng)目）（2007AA021007，2007AA02Z454）。

100853北京市中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院（邊素艷，蓋魯粵，葉平）；100850北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室（郭子寬，王華，王立生）。

王立生。