七鰓鰻含硒谷胱甘肽過氧化物酶2 的分子克隆、 生物學(xué)特性及表達(dá)分析

趙春暉，徐 瑋，王 丹，逄 越，劉 欣，李慶偉

（1. 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081；2. 遼寧師范大學(xué) 七鰓鰻研究中心，遼寧 大連 116081）

谷胱甘肽過氧化物酶(Glualhione peroxidase，GPx)是活細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一?？寡趸烙到y(tǒng)保護(hù)了細(xì)胞免受活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的破壞性影響。ROS 是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，包括超氧陰離子自由基(O2-)，過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(OH-)。高濃度活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激，能夠造成脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、DNA 損傷、膜破裂和線粒體功能障礙[1-2]。所有的動物，包括魚類，都具有保護(hù)自身組織免受氧化應(yīng)激的影響和防止脂質(zhì)過氧化作用的抗氧化系統(tǒng)。這些系統(tǒng)是由膳食中的抗氧化劑類的維生素和礦物質(zhì)（如維生素E 和硒），細(xì)胞中的抗氧化劑（如谷胱甘肽）和抗氧化酶（如過氧化氫酶和GPxs）構(gòu)成的[3]。硒依賴的谷胱甘肽過氧化物酶家族中GPx1 和GPx2 酶同源性較高，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫水平和烷基氫過氧化物。它們的區(qū)別在于GPx1 幾乎在所有類型的細(xì)胞中都表達(dá)，而GPx2 主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)[4-5]。

七鰓鰻(Lampetra japonica)屬無頜脊椎動物，是現(xiàn)存脊椎動物中最古老、最原始的物種之一。其化石記錄可以追溯到志留紀(jì)及泥盆紀(jì)，有現(xiàn)存的“活化石”之稱，它印記了從無脊椎動物到脊椎動物的進(jìn)化歷史，同時作為脊椎動物的祖先，又為脊椎動物的起源與進(jìn)化提供豐富的遺傳信息基礎(chǔ)。幼體七鰓鰻生活在淡水中，變態(tài)后遷移到海洋中以吸食其它魚類的血肉為生，性成熟后停止進(jìn)食，洄游到淡水中產(chǎn)卵后死亡。七鰓鰻既是研究脊椎動物進(jìn)化、胚胎發(fā)育、適應(yīng)性免疫起源理想的模式動物[6-7]，也具有較高食用和藥用價值[8]。在本研究中,我們首次克隆得到七鰓鰻GPx2 基因cDNA 全長序列及基因組序列，并進(jìn)行了序列進(jìn)化和組織特異性分析， 同時研究了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后該基因表達(dá)水平的變化，為闡明GPx2 在七鰓鰻免疫防御中的作用和脊椎動物GPx 家族的起源提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：12 月份由黑龍江省松花江流域同江地區(qū)購買成年七鰓鰻(L. japonica)，七鰓鰻體重大約112.0~274.5 g，體長大約36.4～58.4 cm，魚的活體馴養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室水族箱內(nèi)(2～5℃)。

菌株與質(zhì)粒：質(zhì)粒pMD18-T 購自寶生物工程（大連）公司；大腸桿菌DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0 、 Clontech SMART? RACE cDNA Amplification Kit、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒、TaKaRa MiniBEST Ver.5.0 DNA 試劑盒及DNA Marker 均購于寶生物工程（大連）公司；引物合成及重組質(zhì)粒目的基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司測定；Trizol 試劑購自GIBCO BRL。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

健康活躍日本七鰓鰻個體斷尾取血，采用ficoll密度梯度離心法進(jìn)行單個核白細(xì)胞分離，取0.2 g 左右白細(xì)胞，加入1 mL Trizol 試劑制備勻漿，冰上孵育5 min；加入0.2 mL 氯仿，振蕩混勻15 s，直至溶液呈乳白色且無分相現(xiàn)象后于冰上靜置5 min，4℃，12 000 ×g，離心10 min。離心后勻漿液分為三層，小心吸取上層溶液600 μL 至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，振蕩充分混勻，冰上孵育30 min；4℃，12 000 ×g，離心10 min，小心棄去上清，保留離心管底的少量白色沉淀；緩緩加入1 mL 預(yù)冷的DEPC 配置的75%乙醇，洗滌沉淀，4℃，12000 g，離心5 min，小心吸去上清，保留沉淀；再次洗滌、離心后獲得RNA 沉淀；空氣中干燥后，用適量TE 或無RNase水溶解備用。使用 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase Hˉ)，以總RNA 為模板，以O(shè)ligo dT 為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為：42℃ 60 min，70℃ 15 min，5℃ 5 min。

1.2.2 LjGPx2 cDNA 的全長獲得

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的七鰓鰻白細(xì)胞cDNA 文庫中調(diào)取LjGPx2 的EST 片段，將獲得的GPx2 序列與其它同源性較高的物種進(jìn)行序列比對，得到保守的序列，使用primers5.0 軟件設(shè)計(jì)引物見表1。使用上述制備的cDNA 作為模板，基因擴(kuò)增PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min，35 個循環(huán)94℃ 1 min，52℃ 30 s，72℃ 1 min，最后72℃下延伸10 min。將所得的PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，并且克隆到pMD18-T 載體進(jìn)行DNA 測序。3'-RACE 擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min，30個循環(huán)94℃ 30 s，54.5℃ 30 s，72℃ 1 min，最后循環(huán)是72℃ 10 min，5'-RACE 擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min，30 個循環(huán)94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 90 s，最后循環(huán)是72℃ 10 min，將PCR 產(chǎn)物克隆到pMD18-T 上，并導(dǎo)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)菌中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA 測序。3'和5'片段的拼接用的是DNA man (Lynnon Biosoft)軟件并獲得LjGPx2 cDNA 全長。

表1 PCR 引物的序列

1.2.3 基因組DNA 序列及結(jié)構(gòu)分析

提取七鰓鰻白細(xì)胞基因組DNA 并保存在-20℃?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)引物見表1，PCR 擴(kuò)增的條件是：94℃ 3 min，35 個循環(huán)94℃ 1min，55℃ 30 s，72℃ 90s，最后的循環(huán)是72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，并進(jìn)行DNA 測序。GPx2 外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析使用的是NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫，查找其它物種GPx2 核苷酸序列，將GPx2 核苷酸序列輸入Ensemble 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對，用比對的結(jié)果分析外顯子-內(nèi)含子數(shù)目并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

開放閱讀框(ORF)分析使用NCBI 在線預(yù)測軟件。信號肽預(yù)測使用SignalP 4.1。使用ClustalX 2.0 軟件進(jìn)行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的用Neighbor-joining(NJ)法和MEGA6.0 軟件。

1.2.5 Real Time PCR 法檢測目的基因的相對表達(dá)量

七鰓鰻分為兩組，一組為對照組，另一個是LPS刺激組。刺激組用200 μL(50μg/mL) LPS 進(jìn)行腹腔注射，對照組腹腔注射200 μL 0.9%氯化鈉，加強(qiáng)免疫三周后提取組織和白細(xì)胞mRNA 凍存于-80℃保存?zhèn)溆肹9]。使用Trizol 試劑提取口腔腺、心臟、肌肉、肝臟、腎臟、鰓、腸、骨髓、生殖腺、卵和白細(xì)胞中總RMA。實(shí)時定量PCR 反應(yīng)體系包含12.5 μL Master SYBR Green (TaKaRa) mix，1 μL 引物(10 μM)，2 μL cDNA (100 ng/μL)和水，總體系25 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 95℃ 30 s，40 個擴(kuò)增循環(huán) 95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s。以七鰓鰻GAPDH 基因作為內(nèi)參，上述所有反應(yīng)均重復(fù)三次。TaKaRa TP800 PCR 檢測系統(tǒng)分析得到特異性的溶解曲線和擴(kuò)增曲線。使用2-ΔΔCt方法對LjGPx2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行計(jì)算分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 七鰓鰻LjGpx2 基因克隆及序列分析

圖1 顯示LjGPx2 全長868 bp，其中包括564 bp ORF 區(qū)，53bp 5′UTR 區(qū)和251bp 3′UTR 區(qū)。LjGPx2 ORF 區(qū)564bp，編碼187 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量預(yù)測為20.57 kDa。由終止密碼子編碼的酶活性位點(diǎn)為硒代半胱氨酸(36 TGA)。LjGPx2 具有含硒GPxs均含有的LGFPCNQF 序列和WNFEKF 活性部位[11]。谷氨酰胺(Q67，Q71)和色氨酸(W139，W149)參與硒的固定。四個精氨酸殘基(R41，R87，R144，R165)為谷胱甘肽底物催化中心。SECI Search 2.19 程序鑒定了3′UTR 區(qū)含有1 個硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS)(如圖1)。3′UTR 區(qū)含有AATAAA 多聚腺苷酸信號。LjGPx2 沒有檢測到信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。LjGPx2 序列已被提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(序列號KM211710)。

圖1 LjGPx2 核酸和氨基酸序列

黑框內(nèi)ATG 是起始密碼子，TAG 是終止密碼子；灰色陰影為硒代半胱氨酸TGA(sec)，精氨酸殘基(R41，R87，R144，R165)，谷氨酰胺(Q67，Q71)和色氨酸(W139，W149)；下劃線為LGFPCNQF 序列和WNFEKF 活性部位，3'UTR 區(qū)SECIS 元素插入位點(diǎn)，3’ UTR 區(qū)AATAAA 多聚腺苷酸信號。

多序列比對結(jié)果表明，七鰓鰻GPx2 氨基酸序列與其它無脊椎動物和脊椎動物GPx2 有很高的保守性，含有同源序列和硒代半胱氨酸位點(diǎn)U(如圖2)。使用Mega6.0軟件中neighbor-joining建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹主要包括兩大類群(如圖3):(1)哺乳動物和鳥類 (2)爬行動物，兩棲動物和魚類。在系統(tǒng)發(fā)育樹中LjGPx2 位于“爬行動物，兩棲動物和魚類”分支。

2.2 LjGPx2 基因組結(jié)構(gòu)分析

圖2 LjGPx2 氨基酸同源序列比對

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

測序得到LjGPx2 基因組序列共3471bp，并提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(序列號KM211711)。LjGPx2 包含兩個外顯子(54-266 bp，2870-3220 bp)和1 個內(nèi)含子區(qū)域，所有外顯子-內(nèi)含子邊界均有拼接受體(AG)和(GT)位點(diǎn)。圖4 是與其它同源GPx2 基因組結(jié)構(gòu)比較，哺乳動物、魚類和兩棲類的基因組結(jié)構(gòu)包含2 個外顯子編碼區(qū)和1 個內(nèi)含子區(qū)。sinensis)GPx2，XP_006111005.1；褐家鼠(Rattus norvegicus)GPx2，NP_899653.2；牛(Bos taurus)GPx2，NP_001156611.1；白掌長臂猿(Hylobates lar)GPx2，BAE17011.1；家兔(Oryctolagus cuniculus)GPx2，NP_001243822.1；馬(Equus caballus)GPx2，NP_001159953.1；獵隼(Falco cherrug)GPx2，XP_005438368.1；白喉帶鹀(Zonotrichia albicollis)GPx2，XP_005496960.1；鯽魚(Carassius auratus)GPx1，AGC50802.1；豚鼠(Cavia porcellus)GPx1，XP_003476496.1；白犀(Ceratotherium simum)GPx1，XP_004444023.1；中國倉鼠(Cricetulus griseus)GPx1，NP_001243717.1；狼(Canis lupus)GPx1，NP_001108591.1；斑馬魚(Danio rerio)GPx1，NP_001007282.2；斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)GPx1，NP_001187670.2；矛尾魚(Latimeria chalumnae)GPx1，XP_005992733.1；小家鼠(Mus musculus)GPx1，NP_032186.2；虹鱒(Oncorhynchus mykiss)GPx1，NP_001117997.2；斑胸草雀(Taeniopygia guttata)GPx1，NP_001130041.1；熱帶爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis)GPx1，NP_001015740.2；安樂蜥(Anolis carolinensis)GPx1，XP_008103229.

圖4 GPx2 基因組結(jié)構(gòu)比較

2.3 實(shí)時熒光定量PCR 分析LjGPx2 基因在組織中表達(dá)情況

實(shí)時熒光定量PCR 分析日本七鰓鰻各個組織中LjGPx2 的轉(zhuǎn)錄水平。檢測的數(shù)據(jù)表明LjGPx2 在七鰓鰻的肝臟、鰓、腎、腸、心臟、肌肉、口腔腺、髓、生殖腺、卵和白細(xì)胞中均有表達(dá)，但是在口腔腺中表達(dá)最高(GAPDH mRNA 表達(dá)水平的58.4 倍)，在卵(58.2 倍)、心臟(55.0 倍)、生殖腺(51.7 倍)表達(dá)較高。在肝臟(5.9 倍)和腎臟(9.3 倍)中表達(dá)量低。通過LPS刺激后，與其它組織相比較，LjGPx2 在生殖腺中的表達(dá)量明顯的升高(刺激后較對照組升高3 倍；P< 0.05)，在腸中升高2.3 倍(刺激后較對照組)，在卵中升高1.4 倍(刺激后較對照組)(圖5)。

3 討論

七鰓鰻以其獨(dú)特的進(jìn)化地位和獨(dú)有的免疫系統(tǒng)成為研究脊椎動物免疫系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)起源和進(jìn)化的重要物種。本研究首次克隆了GPx2 cDNA 全長序列。GPx2 全長868 bp，其中ORF 區(qū)為564 bp，編碼由187 個氨基酸組成的多肽。GPx2 基因保留了較多高度保守的殘基(R41，Q67，Q71，W140，W149，R87，R144，R165，和U36)和氨基酸序列(LGFPCNQF，WHFEKFL)。硒代半胱氨酸(Sec)是由終止密碼子(TGA)編碼，位于該基因的第36 個氨基酸。這種編碼機(jī)制依賴于特殊的Sec t-RNA、延長因子及通過形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)來幫助Sec tRNA 識別TGA 密碼子的位于mRNA 3′-UTR 中的SECIS[12]。

圖5 LjGPx2 mRNA 在免疫前后七鰓鰻各組織中相對表達(dá)量分析

氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，七鰓鰻的GPx2 同其它物種的GPx1 和GPx2 具有較高的同源性，與GPx2 家族的相似性更近；同時該結(jié)果也說明七鰓鰻可能單獨(dú)成為一個進(jìn)化分支，位于高等脊椎動物GPx2 基因的外群，這也與目前研究的七鰓鰻的進(jìn)化地位是相一致的。

GPx2 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的一個重要的組成部分，我們分析了GPx2 基因在七鰓鰻各組織中分布情況，結(jié)果表明，GPx2 在多種組織中均有表達(dá)，提示其作為一種重要的抗氧化酶，在維護(hù)組織正常功能方面可能發(fā)揮著非常重要的作用。其中在口腔腺中高表達(dá)，可能與它的生活習(xí)性相關(guān)；成年的七鰓鰻以吸食魚體為食，口腔腺作為第一道免疫防御系統(tǒng)具有重要作用。其次，在卵和生殖腺中有較高的表達(dá)，提示GPx2 可能在保護(hù)卵和生殖腺免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。腸道黏膜組織是先天性免疫系統(tǒng)重要組成部分，擔(dān)負(fù)著重要的免疫功能，GPx2 在腸中表達(dá)量也較高，表明GPx2 與腸道免疫過程相關(guān)。在哺乳動物中，GPx2 是胃腸道專屬性類型[12]。脂多糖LPS刺激后LjGPx2 在生殖腺中的表達(dá)水平與對照組相比升高3 倍，在卵中的表達(dá)水平升高1.4 倍。表明GPx2可能參與七鰓鰻生殖免疫應(yīng)答反應(yīng)，但相關(guān)的反應(yīng)機(jī)制還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

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