一株產(chǎn)脂肽類生物表面活性劑菌株的分離及代謝產(chǎn)物分析

生物表面活性劑是微生物代謝產(chǎn)生的一種具有表面活性的兩性分子，分為糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及多聚糖脂等不同種類[1]。從油藏環(huán)境中篩選培養(yǎng)可以產(chǎn)生物表面活性劑的微生物(主要是假單胞菌和芽孢桿菌)[2]，其代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑主要為糖脂和脂肽兩大類。

脂肽分子是由親水的肽鏈(7～10個(gè)氨基酸組成的肽鏈)和親油的脂肪酸鏈(β-羥基脂肪酸鏈或β-胺基脂肪酸鏈)兩部分組成的, 其中脂肪酸鏈上的羥基或胺基與肽鏈氨基酸上的羧基結(jié)合形成內(nèi)酯鍵或酰胺鍵,使肽鏈閉合形成環(huán)狀脂肽[3]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，脂肽表現(xiàn)出多種生理特性[4,5]：幫助微生物細(xì)胞粘附于烴類物質(zhì)表面進(jìn)行解烴代謝; 降低表面張力,促進(jìn)微生物吸收和代謝疏水性物質(zhì), 以利于微生物在水不溶性物質(zhì)中生存；與化學(xué)表面活性劑相比，更易于降解；在極端條件下仍能保持其活性[6～8]。因此，脂肽被廣泛地應(yīng)用到石油開采等工業(yè)領(lǐng)域中。

作者在此采用多次富集馴化、血平板篩選方法從新疆克拉瑪依油田的油水樣中分離出3株產(chǎn)生物表面活性劑的菌株。對(duì)其中的L1菌株進(jìn)行研究，通過分子生物學(xué)鑒定該菌與土壤芽孢桿菌同源關(guān)系最近。為脂肽類生物表面活性劑的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

油水樣取自新疆克拉瑪依油田，密封，備用。

TLC 展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶15∶2(體積比),顯色劑為0.2%茚三酮水溶液,HSGF 254 硅膠板。甲醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸、茚三酮等均為分析純。

UV-2102C型紫外可見分光光度計(jì)，SIGMA Laborzentrifugan 3K15型離心機(jī)，K12/ M14型表面張力測(cè)定儀，NICOLET 750型顯微紅外光譜儀。

1.2 培養(yǎng)基

(1)產(chǎn)表面活性劑菌富集培養(yǎng)基:液體石蠟1 g·L-1,MgSO40.2 g·L-1,CaCl20.02 g·L-1,KH2PO41 g·L-1,K2HPO41 g·L-1,FeCl30.05 g·L-1,NH4NO31 g·L-1,酵母膏1 g·L-1，蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

(2)血瓊脂培養(yǎng)基:購(gòu)自北京綠源旺業(yè)科技有限公司。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖25 g·L-1，KH2PO41 g·L-1,K2HPO41 g·L-1, CaCl20.04 g·L-1,NaCl 20 g·L-1, MgSO40.2 g·L-1,Na2HPO46 g·L-1,蛋白胨7.5 g·L-1,酵母膏 0.8 g·L-1,蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

(4)斜面培養(yǎng)基:牛肉膏5 g·L-1,蛋白胨10 g·L-1， NaCl 5 g·L-1，瓊脂 10 g·L-1，蒸餾水定容至1 L，pH值7.0。

1.3 分離方法

1.3.1 菌種的富集與分離

油水樣以2%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種到產(chǎn)表面活性劑菌富集培養(yǎng)基中，25℃、165 r·min-1恒溫培養(yǎng)3 d。吸取4 mL培養(yǎng)液接種到200 mL已滅菌的新鮮富集培養(yǎng)液中，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接10次。將富集培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，取0.1 mL均勻涂布于血平板上，25℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)溶血環(huán)進(jìn)行初步篩選。挑產(chǎn)溶血環(huán)的單菌落于牛肉膏平板上劃線分離4次，直至得到單菌落。顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)一致。保存于牛肉膏斜面。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

分離的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中, 170 r·min-1、25℃培養(yǎng) 96 h。

1.3.3 生物表面活性劑的提取[9]

取一定量發(fā)酵液,用NaOH 溶液將pH 值調(diào)至7.5～9.0，10 000 r·min-1離心15 min； 取上清液，用鹽酸調(diào)pH 值至2.0，離心收集沉淀，用等體積的CHCl3/CH3OH(體積比3∶1) 連續(xù)萃取3次；合并萃取相,濃縮,用pH值2.0 的鹽酸水溶液洗滌5 次,減壓蒸發(fā)除去有機(jī)相,用NaOH 溶液將沉淀物的pH 值調(diào)至7.0，真空干燥;加入正己烷洗滌3 次除去脂肪酸等,離心收集沉淀物并干燥,最后用CH2Cl2于50℃抽提10 h，除去CH2Cl2，即得生物表面活性劑。

1.4 分析與鑒定

1.4.1 生物表面活性劑的定性分析

采用薄層層析分析法。取提取的生物表面活性劑粗品溶于二氯甲烷中，將樣品點(diǎn)在硅膠板上，展開，用茚三酮原位水解顯色[10]檢測(cè)。

1.4.2 乳化指數(shù)的測(cè)定[11]

發(fā)酵液以10 000 r·min-1離心30 min，取上清液 4 mL,加入 6 mL煤油充分振蕩 2 min,靜置 24 h。觀察乳化層高度及穩(wěn)定性,按下式計(jì)算 24 h乳化指數(shù)(E24)。

1.4.3 表面張力的測(cè)定

發(fā)酵液以8000 r·min-1離心20 min,取上清液測(cè)定其表面張力，對(duì)照樣為沒有加入菌種的新鮮培養(yǎng)基。

1.4.4 菌株鑒定

將分離純化后的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，25℃、150 r·min-1培養(yǎng)16～20 h，離心收集細(xì)胞后用基因組DNA提取試劑盒[Tiangen Biotech (Beijing) Co.,Ltd.]提取純菌DNA。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTACGACT-3′)用于基因組16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增，DNA凝膠回收試劑盒[Tiangen Biotech (Beijing) Co.,Ltd.]純化16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物。pGEM-T Easy vector system(Promega)將16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增片段與載體連接，連接產(chǎn)物通過CaCl2法轉(zhuǎn)化到Trans5αchemically competent cell感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑取10個(gè)白斑單克隆用于ARDAR分析。牙簽挑取少量的菌體作為模板DNA，通用引物T7(5′-GGCCGCGGGAATTCGATT-3′)和Sp6( 5′-GCGAATTCACTAGTGATT-3′)用于陽性克隆驗(yàn)證。陽性克隆PCR產(chǎn)物分別用HinfI 和HhaI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。挑取2個(gè)分型相同的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序(SinoGenoMax Co., Ltd., Beijing)，應(yīng)用DNAMAN(Version 5.2.2.0)軟件對(duì)原序列進(jìn)行編輯，非嵌合體序列在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

對(duì)油水樣進(jìn)行富集培養(yǎng)，稀釋10 000倍后，取0.1 mL涂布于血平板上，利用產(chǎn)生物表面活性劑菌可以產(chǎn)生溶血圈的特性，劃線分離得到3株菌，其中溶血圈最大的一株命名為L(zhǎng)1。

2.2 16S rDNA序列分析結(jié)果

菌株L1 16S rDNA(約1500 bp)序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較結(jié)果為：該菌株與已培養(yǎng)的土壤芽孢桿菌(Brevibacillusagri)同源性最近，達(dá)到了99%。與該菌同源性超過98%的已知菌系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖1。

圖1 依據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株L1和相關(guān)屬菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生物表面活性劑乳化性能

圖2是生物表面活性劑對(duì)煤油的乳化指數(shù)隨時(shí)間變化的關(guān)系。從圖2可以看出，在72 h后，乳化指數(shù)仍達(dá)到64%，說明該生物表面活性劑對(duì)煤油乳化穩(wěn)定性良好。

圖2 生物表面活性劑的乳化性能

2.4 生物表面活性劑的定性分析

發(fā)酵液預(yù)處理后，用鹽酸調(diào)pH值至2，4℃靜置過夜，產(chǎn)生沉淀，說明發(fā)酵液中有脂肽存在[12]。TLC分析及顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，直接用茚三酮進(jìn)行染色，不顯色；將薄層板放入裝有濃鹽酸的密封瓶?jī)?nèi)于 150℃原位水解后，再用茚三酮染色，顯紅色斑點(diǎn)。表明表面活性劑本身不含游離氨基，酸解后可產(chǎn)生游離氨基[13]，確定發(fā)酵液中含有脂肽類表面活性劑。

表面活性劑的紅外光譜分析結(jié)果見圖3。

圖3 樣品的FTIR圖

在 FTIR譜圖上，3289.6 cm-1是由分子鏈間氫鍵引起的NH收縮振動(dòng)譜帶,1540.0 cm-1為酰胺譜帶Ⅱ，這表明表面活性劑分子的親水基是肽鏈。2947.7～2857.2 cm-1和1458.7～1374.8 cm-1的兩處吸收峰是脂肪族碳鏈的 C—H伸縮振動(dòng)峰，1713.7 cm-1和1177.7 cm-1是內(nèi)酯的特征吸收峰，表明表面活性劑分子的疏水基是脂肪酸半分子。因此，可判定該表面活性劑分子是環(huán)脂肽類分子。

紅外光譜測(cè)定的圖譜與文獻(xiàn)所載的紅外光譜圖有所不同[9]，可能是樣品不純所致，也可能產(chǎn)生的是一種新型脂肽。

菌株在含有0.4%葡萄糖基本無機(jī)鹽的培養(yǎng)基(pH值為7)中，45℃、170 r·min-1培養(yǎng)不同時(shí)間，取樣測(cè)定細(xì)菌濃度和發(fā)酵液的表面張力,結(jié)果見圖4。

圖4 細(xì)菌濃度和表面張力的關(guān)系

由圖4可看出，發(fā)酵前培養(yǎng)基的表面張力為69.56 mN·m-1，發(fā)酵后表面張力為29.36 mN·m-1。隨著細(xì)菌濃度的增加，表面張力逐漸降低,說明表面活性劑的產(chǎn)量逐漸升高，但是產(chǎn)量的最大值出現(xiàn)在細(xì)菌濃度的最大值之后，這說明表面活性劑是細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，細(xì)菌在生長(zhǎng)遲滯期大量分泌表面活性劑[14]。

3 結(jié)論

從克拉瑪依油田油水樣中分離得到3株產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其中一株與土壤芽孢桿菌同源關(guān)系最近，能夠在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的條件下生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物為脂肽類生物表面活性劑。

該菌株代謝產(chǎn)物具有降低表面張力的能力，可以將發(fā)酵液的表面張力從69.56 mN·m-1降低到29.36 mN·m-1，對(duì)煤油具有較高的乳化活性。該菌株在微生物采油上具有較大的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1] Soumen Mukherjee , Palashpriya Das , Ramkrishna Sen . Rapid quantification of a microbial surfactant by a simple turbidometric method[J].Journal of Microbiological Methods,2009,76(1):38-42.

[2] 佘躍惠,夏晶晶，黃金鳳,等.大慶油田聚驅(qū)后油藏驅(qū)油本源菌研究[J].油田化學(xué)，2009，26(1): 98-101.

[3] Kosaric N, Cairns W L. Biosurfactants and Biotechnology[M]. New York:Marcel Dekker Inc, 1987：21-45.

[4] Peypoux F, Bonmatin J M, Wallach J. Recent trends in the biochemistry of surfactin[J]. Appl Microbiol Biotech，1999, 51(5): 553-563.

[5] Tulin E E, Amaki Y, Nagasawa T, et al. ABacillusstearothermophilusesterase produced by a recombinantBacillusbrevisstabilized by sulfhydryl compounds[J]. Biosci Biotechnol Biochem，1993, 57(5): 856-857.

[6] Batista S B, Mounteer A H, Amorim F R,et al. Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites[J]. Bioresour Technol， 2006,97(6):868-875.

[7] Costa S G, Nitschke M, Haddad R, et al. Production ofPseudomonasaeruginosaLBI rhamnolipids following growth on Brazilian native oils[J]. Process Biochem， 2006,41(2):483-488.

[8] Thanomsub B, Pumeechockchai W, Limtrakul A, et al. Chemical structures and biological activities of rhamnolipids produced byPseudomonasaeruginosaB189 isolated from milk factory waste[J]. Bioresour Technol， 2006,97(18):1149-1153.

[9] 陳濤, 楊世忠, 牟伯中.微生物發(fā)酵液中脂肽類生物表面活性劑的測(cè)定[J].油田化學(xué)，2004，21(4)：385-390.

[10] 呂應(yīng)年，楊世忠，牟伯中.一種脂肽類生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選[J].微生物雜志，2005，25(2)：4-8.

[11] Cooper D G,Goldenberg B G. Surface-active agents from twoBacillussp.[J]. Appl Environ Microbiol，1987，53(2) :224-229.

[12] 楊樂，魯建江，王開勇，等.石油降解菌的篩選及其產(chǎn)表面活性劑的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,27(2):221-225.

[13] 周俊,譚寧華.植物環(huán)肽的薄層化學(xué)識(shí)別新方法及其在植物化學(xué)研究中的應(yīng)用[J].科學(xué)通報(bào),2000，45(10) : 1047-1051.

[14] Ohno A，Ano T，Shoda M. Production of a lipopeptide antibiotic，surfactin，by recombinantBacillussubtilisin solid state fermentation[J].Biotechnology and Bioengineering，1995，47(2):209-214.