不同豆科牧草總皂苷含量的測定

沈 靜,呂文坤,曹致中

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅蘭州 730070)

紫花苜蓿、新疆大葉苜蓿、白花苜蓿為豆科苜蓿屬植物,其中紫花苜蓿,新疆大葉苜蓿營養(yǎng)物質(zhì)含量非常高,常作為飼料而被廣泛種植,多分布于我國長江以北的廣大地區(qū),西起新疆,東到江蘇北部的14個(gè)省市自治區(qū),主產(chǎn)區(qū)在黃河流域的華北、西北地區(qū)。在我國20世紀(jì)90年代初苜蓿種植面積約有133萬hm2,居世界第6位[1]。近年來隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,面積有所增加,現(xiàn)在栽培面積約188萬hm2[2]。白花苜蓿是育種工作者從大田中挑選出的開白花的苜蓿品系。小冠花又名多變小冠花,是豆科小冠花屬多年生草本植物,原產(chǎn)于南歐和地中海一帶,在加拿大和美國種植較多,近年來才引入我國,具有抗旱、抗?jié)场⒖共∠x害、耐貧瘠等優(yōu)良的抗逆性[3,4]。紅豆草又稱驢食豆和圣車軸草,原產(chǎn)于歐洲,是豆科紅豆草屬多年生草本植物,在我國許多地方有引種,栽培效果良好。紅豆草具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒能力,一次種植可利用4～6年[5]。紫云英又稱紅花草,廣泛分布于N 24°～35°地區(qū),喜溫暖濕潤條件,有一定耐寒能力,養(yǎng)分含量和飼料價(jià)值較高[6]。百脈根是豆科百脈根屬多年生草本植物,原產(chǎn)于歐亞兩洲溫帶,19世紀(jì)后期開始栽培。性喜溫暖濕潤氣候,耐寒、抗旱、耐瘠薄,我國多個(gè)地方均有野生種分布,在引種方面做了大量的試驗(yàn),但都未在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[7]。目前,豆科植物的利用主要集中于青飼和干草加工,對(duì)生物活性的研究很少,其藥用功能尚未被很好的開發(fā)利用。

上述幾種豆科牧草在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中具有重要的作用,在民間作為傳統(tǒng)草藥已有千余年的歷史?！吨兴幋筠o典》記載其主要功能為:“清脾胃,利大小腸,下膀胱結(jié)[8]?！碧蘸刖爸睹t(yī)別錄》將苜蓿列為菜之上品[9]?！侗静菅芰x》記載苜?！袄笮∧c”[10];《本草綱目》謂其有“利五臟,輕身健人”之功效[11]。研究表明苜蓿能防止動(dòng)物的高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的形成,也能降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高膽固醇血癥,并引起粥樣化板塊的消失,這種作用被認(rèn)為是由其中的苜蓿皂苷引起的[12],其他幾種豆科牧草在次生代謝方面的研究報(bào)道比較少。因此,將以上豆科植物作為原料來研究開發(fā)降血脂及其他生物活性方面的藥物具有很廣闊的前景。

幾種豆科植物所含的皂苷為齊墩果烷型或常春藤型三萜皂苷,兩者結(jié)構(gòu)很相似[13-19],與香草醛-冰醋酸顯色劑反映均呈紫紅色,齊墩果酸為齊墩果烷型或常春藤型三萜皂苷的苷元或類似物,故選擇易得的齊墩果酸為對(duì)照品。文獻(xiàn)報(bào)道中齊墩果烷型皂苷多用5%香草醛-冰醋酸顯色,顯色液呈紫色,顯色液在550 nm處有最大吸收值,用分光光度法測定[8]。試驗(yàn)采用不同豆科牧草為材料,利用分光光度法測定比較了總皂苷的含量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 紫外可見分光光度計(jì)(UNICO UV-2000,上海欣茂儀器有限公司出品),數(shù)控超聲波清洗器(KQ2250DE,昆山市超聲儀器有限公司出品),電熱恒溫水浴鍋(KE-WeI,北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52,上海亞榮生化儀器廠),電熱板(浙江省嘉興縣新勝電器廠),精密電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國制造)。

1.1.2 試劑 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%,購自上海源葉生物科技有限公司)、高氯酸、香草醛、甲醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),正丁醇、乙酸乙酯(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司),冰醋酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠),丙酮(天津化學(xué)試劑有限公司),以上試劑均為分析純。

1.1.3 試樣 甘農(nóng)三號(hào)紫花苜蓿(Medicago sativa cv.Gannong No.3)、新疆大葉苜蓿(Medicago sativa cv.Xinjiang Daye)、白花苜蓿(Medicaqo sativa cv.Baihua)的莖、葉、花及全株;小冠花(Coronilla varia)、鷹嘴紫云英(Astragalus sinicus)、紅豆草(Onobrychis vicii folia)、百脈根(Lotuscorniculatus)的全株。以上材料均采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院景泰試驗(yàn)基地,在盛花期選擇生長勢一致、健康無病的3種苜蓿植株分莖、葉、花及全株刈割,其余牧草收割全株,室內(nèi)蔭干后粉碎,過60目篩,備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取在105℃干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)品齊墩果酸5.0 mg,用甲醇定容于50 mL的容量瓶,搖勻,得到濃度為10 mg/100 mL的齊墩果酸甲醇溶液,備用。

1.2.2 供試樣品總皂苷的提取和溶液的配制 精確稱取同一批材料過60目篩的樣品粉末1.000 0 g,于100 mL的小燒杯中加入50 mL水煮1.5 h,每個(gè)樣品3次重復(fù),真空抽濾并加開水洗滌至流出液無色為止,水提液加正丁醇萃取,后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收正丁醇,所得濃縮液放入燒杯中加丙酮沉淀,離心除去上清夜,洗滌沉淀,沉淀在80℃揮干水分。最后用甲醇溶解沉淀,將溶解液轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中,剩余在小燒杯中的液體繼續(xù)加甲醇溶解,將所有溶解液都轉(zhuǎn)移入容量瓶中,并用甲醇定容至100 mL,搖勻后轉(zhuǎn)移入小燒杯中備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取 0.000 0、0.300 0 、0.400 0 、0.500 0 、0.600 0 、0.700 0 、0.800 0 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于具塞試管中,水浴蒸干溶劑,加入新配5%香草醛-冰醋酸溶液0.20 mL,高氯酸0.80 mL密塞,搖勻后于70℃恒溫水浴鍋中加熱15 min,取出后立即用流水冷卻,加乙酸乙酯5.00 mL搖勻,反應(yīng)混合物供測試用[8]。以沒加標(biāo)準(zhǔn)品隨行液做空白對(duì)照,于550 nm測其吸光度(A),以濃度(x,mg/100 mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。經(jīng)回歸處理,得回歸方程:y=0.081 8x-0.038 1,R2=0.999 0。結(jié)果表明齊墩果酸在1～10 mg/100 mL線性關(guān)系良好。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密移取齊墩果酸對(duì)照樣品溶液0.2 mL于具塞試管中,重復(fù)7次水浴蒸干溶劑,按上述1.2.3顯色條件顯色,流水冷卻至室溫,550 nm處測定吸光度。其中RSD=1.62%,結(jié)果表明,試驗(yàn)儀器精密度良好。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 mL,其余按1.2.4步驟操作,配制反應(yīng)液,以實(shí)際空白做對(duì)照,在550 nm處測定吸光值。每10 min測定1次,在60 min內(nèi)樣品的吸光值見圖2。由圖可以看出,隨時(shí)間延長吸光值逐漸降低,但在60 min內(nèi)變化不明顯,故此樣品穩(wěn)定性較好。

1.2.6 樣品的測定 精密量取供試樣品溶液0.2 mL于具塞試管,每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),以試樣空白作參照,按上述1.2.3中方法操作,測得吸收值。計(jì)算供試樣品總皂苷含量?？傇碥蘸康挠?jì)算公式:總皂苷含量(mg/g)=(C×V)/W。其中C為提取液總皂苷的濃度(mg/100 mL);V為提取液體積(100 mL);W為樣品質(zhì)量1.000 0 g。

圖1 齊墩果酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid standard

圖2 穩(wěn)定性試驗(yàn)曲線Fig.2 The absorbance curve under different time

3 結(jié)果與分析

供試苜蓿均為花中的總皂苷含量最高,葉居中,莖中的含量最低。新疆大葉苜蓿莖、葉、花中總皂苷的含量分別為2.798,4.471和6.519 mg/g;甘農(nóng)三號(hào)紫花苜蓿莖、葉、花中的總皂苷含量分別為3.092,5.688和9.757 mg/g;白花苜蓿莖、葉、花中的總皂苷含量分別為3.331,4.270和8.231 mg/g(表 1)。

不同豆科牧草總皂苷含量不同,其中小冠花中含量最高,百脈根中含量最低(表2)。其中總皂苷含量由高到低的順序依次為:小冠花5.928 mg/g、甘農(nóng)三號(hào)紫花苜蓿5.419 mg/g、鷹嘴紫云英 5.018 mg/g、白花苜蓿4.558 mg/g、紅豆草4.197 mg/g、新疆大葉苜蓿4.000 mg/g、百脈根3.189 mg/g。各豆科牧草總皂苷含量差異極顯著(表3)。

表1 苜蓿不同部位總皂苷含量Table 1 The total saponins in different parts of different Alfalfa

表2 豆科牧草全株總皂苷含量Table 2 The total saponins in different Legumes

表3 豆科牧草總皂苷含量Table 3 Variance analysis of the total saponins content in different leguminous forage

試驗(yàn)方法與結(jié)果表明:此實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、簡便、易行,試驗(yàn)過程中的有機(jī)溶劑均可回收利用,在工廠化生產(chǎn)中既節(jié)省成本又對(duì)環(huán)境未造成污染。2種苜蓿品種和1個(gè)苜蓿品系花中的總皂苷含量最高,葉居中,莖的含量最低。不同種豆科牧草總皂苷含量的差異極顯著,其中小冠花總皂苷含最高,而百脈根含量最低。供試豆科牧草總皂苷含量由高到低順序依次為:小冠花5.268 mg/g、甘農(nóng)三號(hào)紫花苜蓿4.715 mg/g、鷹嘴紫云英 4.273 mg/g、白花苜蓿 3.694 mg/g、紅豆草3.398 mg/g、新疆大葉苜蓿3.183 mg/g、百脈根2.304 mg/g。在工廠化生產(chǎn)時(shí)首先選擇資源豐富且總皂苷含量高的豆科植物,但同時(shí)也需注意就地取材,以便節(jié)省成本,獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。

4 討論

豆科牧草含有多種皂苷成分,具有溶血活性及解毒、增強(qiáng)免疫力[8];抗霉菌、真菌作用[11];降血脂、抗癌[16]等,這些作用是多種皂苷共同作用的結(jié)果。國內(nèi)外報(bào)道生物中總皂苷含量的測定方法包括生物測定和化學(xué)測定,在生物測定的方法中,早期使用最多的是利用皂苷有溶血作用的特征,以溶血指數(shù)來計(jì)算皂苷含量等方法[20,21]。但這些方法均存在一定的缺陷。化學(xué)方法測定植物皂苷的最基本方法主要有比色法[14]和薄層法(T LC)[15]。近年來隨著對(duì)植物中皂苷種類、結(jié)構(gòu)的了解,HPLC[15]等方法也被用于植物中總皂苷含量的測定,這類方法可以準(zhǔn)確測定單體皂苷的含量,但需要儀器設(shè)備的支持。試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇比色法測定,選擇齊墩果酸為對(duì)照品在550 nm處測定吸光值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定了幾種豆科植物中總皂苷的含量,并獲得了良好的線性關(guān)系,該方法準(zhǔn)確、簡便、易行。

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