昆明市3種草坪草根際鐮孢菌的分離鑒定

張成霞

(西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院,云南昆明 650224)

鐮孢菌是真菌的一個(gè)重要類群,分布廣泛,是最重要的病原菌之一,引起植物根腐、根頸腐爛、立枯、萎蔫等多種病害[1-3];侵染寄主植物引起的萎蔫病是生產(chǎn)上最難防治的重要病害之一[4]。近10年,對(duì)鐮孢菌侵染植物寄主并造成植物萎蔫的致病機(jī)理、病原菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)展動(dòng)態(tài)規(guī)律以及利用分子生物學(xué)技術(shù)研究鐮孢菌的遺傳變異等,國(guó)內(nèi)外作了大量的研究報(bào)道[5]。自1999年世界園藝博覽會(huì)在昆明召開以來(lái),昆明市草坪種植面積大幅增加,草坪病害也隨之不斷增加。如今,鐮孢菌引起的病害是昆明地區(qū)草坪草的主要病原菌之一[6]。然而,鐮孢菌的分類學(xué)是鐮孢菌生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域研究的基礎(chǔ),也是當(dāng)今世界上的一大難題,從1809年Link建立鐮孢菌屬以來(lái),大約有50多種不同種類的鐮孢菌株得到定名[7];迄今為止,用于鐮孢菌屬的種類劃分已經(jīng)有10種不同的分類系統(tǒng)[8],以往的鐮孢菌分類中,負(fù)侖委貝(Wollenweber)系統(tǒng)和施奈德(Snyder)系統(tǒng)應(yīng)用可以說(shuō)是代表了種的觀念上的兩個(gè)對(duì)立面,前者采取小種化的作法,后者抱大種化的立場(chǎng),兩種極端,各有弊病;Booth以 Wollenweber系統(tǒng)為基礎(chǔ),吸收了Snyder系統(tǒng)的合理部分,推出了44種分類系統(tǒng),受到了人們的普遍歡迎,也得到我國(guó)鐮刀菌工作者的充分肯定[9,10]。采用Booth的分類系統(tǒng),對(duì)云南省昆明市主要種植的3種草坪草根際土壤鐮孢菌進(jìn)行分離培養(yǎng),并對(duì)其進(jìn)行鑒定,以期能為該地區(qū)草坪草病害防治奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集

2009年7月16日,分別采集昆明市高羊茅、多年生黑麥草和草地早熟禾根際樣品,裝入無(wú)菌封口聚乙烯袋,帶回室內(nèi)即分離植物根際土壤真菌。

1.2 方法

1.2.1 鐮孢菌的分離及純化 選用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)[11],采用洗根法分離根際真菌[12],對(duì)分離所得菌株進(jìn)行篩選,并采用單孢分離[13,14],將單孢菌株在柏斯條件下進(jìn)行培養(yǎng)[9,10]。

1.2.2 培養(yǎng)性狀的測(cè)定及形態(tài)鑒定 培養(yǎng)5 d后,測(cè)定菌落直徑,并對(duì)鐮孢菌的小型分生孢子形狀,大小,著生方式;產(chǎn)孢細(xì)胞的類型,大小;大型分生孢子形狀,數(shù)量,著生方式,大小,分隔;子實(shí)體類型,分生孢子座,粘孢團(tuán);厚垣孢子等進(jìn)行觀察和顯微照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅根際鐮孢菌形態(tài)

2.1.1 黃色鐮孢 5 d后菌落直徑48 mm,菌落白色,微顯黃褐色,氣生菌絲較繁茂,絮狀,稍有結(jié)團(tuán)現(xiàn)象,菌背淡黃褐色,中部有褐色小點(diǎn),菌絲無(wú)色。產(chǎn)孢梗長(zhǎng)短不等,上部叢生成。大型分生孢子紡錘型,鐮刀型,彎曲,端部尖細(xì),一般 2～5隔,大小 14.8～32.1×2.42～4.84(23.6×4.43)μ m;小型分生孢子橢圓形,卵形,瓜子形,大小 8.8～19.8×2.2～4.4(14.3×3.3)μ m(圖 1)

2.1.2 茄病鐮孢[Fusariun solani(Mart)Sacc]5 d后菌落直徑35 mm,菌落白色,中等繁茂,生長(zhǎng)均勻,較稀疏,菌背略呈白色,后期底部由內(nèi)到外變桃紅色。產(chǎn)孢梗單瓶梗,多分枝。大型分生孢子極少,小型分生孢子特別多,無(wú)色,棒狀,兩端圓,大小差異大,大小4.6～16.6×1.56～4.8(6.3×3.18)μ m 。

2.2 多年生黑麥草根際鐮孢菌形態(tài)

2.2.1 茄病鐮孢[Fusariun solani(Sacc)Booth]5 d后菌落直徑31 mm,菌落白色,中等繁茂,菌落上層細(xì)密,生長(zhǎng)均勻,中部厚邊緣薄,中部有一灰蘭圈環(huán),內(nèi)部有灰蘭色細(xì)點(diǎn),菌背環(huán)內(nèi)有放射狀蘭綠色小點(diǎn)。產(chǎn)孢梗單瓶梗,在菌絲頂端形成,長(zhǎng)短不等;大型分生孢子棒狀,直或彎曲,兩端稍圓,2～7隔(多3～4隔),大小18.82～37.63×4.12～5.88(30.10×4.89)μ m;小型分生孢子橢圓形,腎形,1～2隔,大小7.06～19.99×2.35～4.70(11.66×3.57)μ m(圖1～3)。

2.2.2 尖孢鐮孢 5 d后菌落直徑44 mm,菌落白色,生長(zhǎng)快,棉絮狀,繁茂,有少量團(tuán)絮;菌底桃紅—紫紅色,有些內(nèi)部有黃色斑塊或黃色放射狀條紋。產(chǎn)孢梗單瓶梗;大型分生孢子美麗型,3～4隔,大小 9.9～22.2×2.2～4.4 μ m小型分生孢子長(zhǎng)橢圓形,香蕉形,短桿狀,0～1隔,大小4.70～16.46×2.53～3.53 μ m 。

2.3 草地早熟禾根際鐮孢菌形態(tài)

2.3.1 茄病鐮孢[Fusarium solani(Mart)Sacc]5 d后菌落直徑25 mm,菌落白色至淡灰綠色,平坦,繁茂,細(xì)絨狀,菌背略呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色放射線及輪紋,菌絲無(wú)色,上生許多孢子球。大型分生孢子較少,多數(shù)美麗型,少數(shù)為馬特型,多1～2隔,大小 16.46～25.87×2.94～4.70 μ m;小型分生孢子較多,長(zhǎng)橢圓形,短桿狀,大小 8.5～16 ×2.7～3.5 μ m;產(chǎn)孢梗直 ,很長(zhǎng) ,二分杈,頂生孢子及孢子球。

2.3.2 雪腐鐮孢 5 d后菌落直徑46 mm,菌落土黃色,稀薄,平鋪,細(xì)絨狀,菌背土黃色,菌絲無(wú)色。大型分生孢子彎月形,兩端尖,大多有一格,少數(shù)無(wú)格,大小11.47～14.11×2.39～2.46 μ m;小型分生孢子很少,橢圓形,大小 3.57～8.63×1.96～2.55 μ m;孢子球很多,未見產(chǎn)孢梗。(圖1～6)。

圖1 黃色鐮孢Fig.1 Fusariumeulmorum

圖2 茄病鐮孢Fig.2 Fusarium solani

圖3 茄病鐮孢Fig.3 Fusarium solani

圖4 尖孢鐮孢Fig.4 Fusariumoxysporum

圖5 茄病鐮孢Fig.5 Fusarium solani

圖6 雪腐鐮孢Fig.6 Fusarium nivale

3 討論

在傳統(tǒng)的真菌分類學(xué)研究中,孢子的性狀一直都是比較和研究的重點(diǎn),鐮孢菌也不例外,其分生孢子的長(zhǎng)度和寬度被認(rèn)作是分種的主要依據(jù)。鐮孢菌是一類較難鑒定的真菌,柏斯分類鑒定系統(tǒng)是目前世界較普遍使用的方法之一。他對(duì)分生孢子梗的性狀,鑒定培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及條件標(biāo)準(zhǔn)化的做法都較穩(wěn)定。根據(jù)柏斯鑒定系統(tǒng),在3種草地中共鑒定出4種鐮孢菌,他們分別是茄病鐮孢、黃色鐮孢、尖鐮孢和雪腐鐮孢,其中茄病鐮孢在高羊茅、多年生黑麥草、草地早熟禾草根際的孢子大小及單孢分離性狀等有差異,他們可能為該種的不同?；?有待繼續(xù)研究鑒定;另外,不同的菌株,即使是在相同的條件下,他們之間也還會(huì)存在一定的差異。張祖新等研究發(fā)現(xiàn),草坪草鐮孢菌腐爛病的病原至少有 6種:F.acuminatum、F.roseum、F.tricinctum 、F.graminearuin、F.culmorum 和 F.rookwellenseum等[17]。許多研究表明,土壤中鐮孢菌的多樣性水平非常高,而且土壤中鐮孢菌多樣性水平對(duì)其中致病菌的種群動(dòng)態(tài)及寄主的抗性表現(xiàn)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響[18]。近年來(lái),rDNA ITS序列分析已用于鐮孢菌的分子鑒定,在形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上用分子系統(tǒng)學(xué)澄清了該屬許多種間、種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、有性型與無(wú)性型的聯(lián)系,而且使得分類系統(tǒng)學(xué)本身得也到了進(jìn)一步的發(fā)展[19-21],因此,對(duì)于鐮孢菌的鑒定應(yīng)該同時(shí)采取多項(xiàng)分類法。本研究通過形態(tài)學(xué)觀察,從昆明市各草坪根際分離鐮孢菌菌株鑒定出4個(gè)種,對(duì)于昆明市植物檢疫、植物鐮孢菌病害防治和鐮孢菌資源的利用,具有一定的參考價(jià)值。

[1]Nyvall R F,Percich J A,Mirocha C J.Fusarium head blight of cultivated and natural wild rice(Zizania palustris)in Minnesota caused by Fusarium graminearum and associated Fusarium spp.[J].Plant Disease,1999,83:159-164.

[2]Wingfield M J,Hammerbacher A,Ganley R J,et al.Pitch canker caused by Fusarium circinatum-a growing threat to pine plantations and forests worldwide[J].Australasian Plant Pathology,2008,37:319-334.

[3]Morgavi D,Riley R T.An historical overview of field disease outbreaks known or suspected to be caused by consumption of feeds contaminated with Fusarium toxins[J].Animal Feed Science and Technology,2007,137:201-212.

[4]Kistler H C,Alabouvette C,Baayen R P.etal.Systematic Numbering of Vegetative Compati-bility Groups in the Plant Pathogenic Fungus Fusarium oxysporum[J].Phytopathology,1999,88:30-32.

[5]王建明,鄭經(jīng)武,賀運(yùn)春,等.西瓜枯萎病在植株體內(nèi)的存在狀態(tài)、數(shù)量分布及擴(kuò)展規(guī)律的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1993,26:69-74.

[6]劉素青.昆明城區(qū)草坪常見病害調(diào)查與防治[J].云南農(nóng)業(yè)科技,2005(4):30-32.

[7]Kvas M,Marasas W F,Wingfield B D,et al.Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex[J].Fungal Diversity,2009,34:1-21.

[8]林清洪,黃志宏.鐮刀菌研究概述[J].亞熱帶植物通訊,1996,25(1):51-56.

[9]布斯.鐮刀菌[M].陳其英,譯.北京:農(nóng)業(yè)出版社,1988.

[10]Booth C.The genus Fusarium[M].Commonwealth mycological institute,1971.

[11]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社出,1979.

[12]中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所.土壤微生物研究方法[M].北京:科學(xué)出版社,1985.

[13]錢存柔,黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,1999.

[14]龔國(guó)淑,徐琴,張敏,等.一種簡(jiǎn)便的病原真菌單孢分離方法研究[J].玉米科學(xué),2010,18(1):126-127,134.

[15]郭明霞,賀運(yùn)春,洪堅(jiān)平,等.山西省忻州地區(qū)土壤鐮刀菌(Fusarium)種類鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(2):171-173.

[16]張俊忠,陳秀蓉,楊成德,等.東祁連山高寒草地土壤5種鐮孢菌的形態(tài)鑒定和ITS rDNA分析[J].草原與草坪,2010,30(2):33-37.

[17]張祖新,鄭巧蘭,王文麗,等.草坪病蟲草害的發(fā)生及防治[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,1999.

[18]Alves-Santos F M,Benito E P,Elsava A P,etal.Genetic Diversity of Fusarium oxysporum Strain from Common Bean Fields in Spain[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65:3335-3340.

[19]Suga H,Hasegawa T,Mitsui H,et al.Phylogenetic analysis ofthe phytopathogenic fungus Fusarium solani based on the rDNA-ITS region[J].Mycologica Research,2000,104(10):1175-1183.

[20]Tomasz K,Gabriel F,Agnieszka P,et al.Development of PCR assay based on ITS rDNA polymorphism for the detection and differentiation of Fusarium sporotrichioides[J].FEMS Microbiology Letters,2004,239:181-186.

[21]Mattila T,M ach R L,Alekhina I A,et al.Phylogenetic relationship of Fusarium langsethiae to Fusarium poaeand Fusarium sporotrichioidesas inferred by IGS,ITS,βtubulin sequences and UP-PCR hybridization analysis[J].International Journal of Food Microbiology,2004,95(3):267-285.