翻白草總黃酮降血糖作用的藥效學(xué)研究

孫海峰，常虹，楊婷，王江鳳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

翻白草為薔薇科委陵菜屬植物翻白草(Potentilla discolor Bunge.)的帶根全草，主要分布在北半球的溫帶和寒帶?！侗静菥V目》載其:氣味甘，微苦，性平，無毒;有清熱解毒、涼血止血功效，主治肺熱咳喘、瀉痢、咳血、吐血、癰腫瘡毒等［1］。近年來民間流行用翻白草治療糖尿病并取得一定療效?，F(xiàn)有研究表明，翻白草具有降血糖作用［2，3］。翻白草所含的黃酮類成分為其降血糖的主要有效成分［4］，本實(shí)驗(yàn)以翻白草總黃酮富集物為材料，研究其對2型糖尿病大鼠空腹血糖、糖耐量、血清胰島素等指標(biāo)的影響，探討翻白草治療2型糖尿病的作用機(jī)制，為翻白草的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

PHB－5筆式酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);日立KY2000半自動生化儀(天津開元醫(yī)療設(shè)備有限公司);恒溫水浴箱(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);微量移液槍(上海榮泰生化工程有限公司);電子分析天平(梅特勒－托利多上海有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);K－Q500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

翻白草總黃酮富集物(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供);糖脈康顆粒(成都中匯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10970026);0.9%NaCl注射液(哈藥集團(tuán)制藥六廠);鏈脲佐菌素(美國sigma公司提供，批號:S0130);胰島素放射免疫試劑盒(北京市福瑞生物工程公司);葡萄糖注射液(哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司);蔗糖(沈陽市新西試劑廠生產(chǎn));葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);冰醋酸(天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司);檸檬酸、膽固醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司);檸檬酸鈉(天津市博迪化工有限公司);葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號:20090101);SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20090527);丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號:20090527)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康wistar大鼠75只，體重(200±20)g，雌雄各半(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)。

2 方法

2.1 藥品及試劑配制方法

檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液的配制:精密稱取檸檬酸2.100g，溶于100mL重蒸餾水中，精密稱取檸檬酸鈉2.900g，溶于100mL重蒸餾水中，將檸檬酸溶液和檸檬酸鈉溶液按1∶1.32配成pH值為4.4的溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配并用酸度計準(zhǔn)確測定)，用0.22μm濾膜除菌，備用。

1%鏈脲佐菌素溶液的配制:精確稱取鏈脲佐菌素100mg，溶于10mL檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液中，搖勻(此操作在冰盒上進(jìn)行，并且避光，所配溶液在30min內(nèi)用完)。

高糖高脂飼料的制備:由10%豬油，2.5%膽固醇，1%膽酸鈉，20%蔗糖，以及66.6%的基礎(chǔ)飼料組成。

翻白草總黃酮富集物低、中、高劑量組配制方法:精密稱取翻白草富集物粉末14.2g、28.4g、56.8g，分別加入282mL蒸餾水，搖勻即得;糖脈康顆粒溶液:取糖脈康顆粒40g加入148mL蒸餾水，搖勻，待用。

2.2 糖尿病大鼠模型的造模與分組

采用喂養(yǎng)高糖高脂飼料加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法。75只Wistar雄性大鼠自購置后適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，將大鼠隨機(jī)分為兩組，空白組10只給予基礎(chǔ)飼料，模型組65只喂以高糖高脂飼料1個月后，于實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，模型組一次性腹腔注射1%的STZ溶液50mg·kg－1，正常組給予同體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液。72h后尾靜脈采血測空腹血糖，選擇血糖值大于11.1mmol·L－1的大鼠作為實(shí)驗(yàn)性糖尿病動物模型，除空白組10只外，共有40只大鼠成模。將其隨機(jī)分為模型對照組、糖脈康組、翻白草總黃酮富集物高、中、低劑量組五組，每組8只。

2.3 實(shí)驗(yàn)給藥方案

空白對照組和模型對照組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。陽性藥物對照組大鼠灌胃給予1.35g·(kg·d)－1糖脈康溶液;翻白草總黃酮高、中、低劑量組分別灌胃給予 36g·(kg·d)－1、18g·(kg·d)－1、9g·(kg·d)－1翻白草總黃酮藥液。實(shí)驗(yàn)各組均連續(xù)灌胃15d。

2.4 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠空腹血糖的測定

大鼠連續(xù)灌胃15d后，各組均禁食不禁水12h，隨后眼內(nèi)眥取血，置離心管中3500r·min－1離心10min，按血糖試劑盒，采用葡萄糖氧化酶法結(jié)合分光光度法測定大鼠空腹血糖值。

2.5 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠糖耐量的測定

大鼠連續(xù)灌胃15d后，禁食不禁水12h，檢測空腹血糖值作為零時血糖值，隨后按3g·kg－1劑量灌胃給予各組大鼠葡萄糖溶液，分別在注射后0.5h、1h及2h測定大鼠血糖值，觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖變化情況。

2.6 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠血清胰島素水平的測定

檢測糖耐量后第2天，各實(shí)驗(yàn)組禁食不禁水12h，眼內(nèi)眥取血，置離心管中3500r·min－1離心10min，精密吸取血清100μL，按照放射免疫試劑盒說明操作，測定大鼠血清胰島素水平。

2.7 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠胰島素敏感性指數(shù)的測定

胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)計算公式為ISI=Ln［1/(FINS×FBG)］，其中 FINS為血清胰島素水平，F(xiàn)BG為空腹血糖含量。將實(shí)驗(yàn)各組FINS和FBG值分別代入公式計算胰島素敏感性指數(shù)值。

2.8 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠超氧化物歧化酶(SOD)的測定

檢測糖耐量后第2天，各實(shí)驗(yàn)組禁食不禁水12h，眼內(nèi)眥取血，置離心管中3500r·min－1離心10min，用半自動生化儀檢測超氧化物歧化酶(SOD)。

2.9 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠MDA的測定

檢測糖耐量后第2天，各實(shí)驗(yàn)組禁食不禁水12h，眼內(nèi)眥取血，置離心管中3500r·min－1離心10min，用半自動生化儀檢測MDA。

2.10 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的觀察

大鼠麻醉采血處死后，迅速取出脾臟周圍的胰腺，置于福爾馬林液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm切片，HE染色后進(jìn)行光鏡檢查。

3 結(jié)果

3.1 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠血糖水平 結(jié)果見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖水平(±s)

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖水平(±s)

注:與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

組別 例數(shù)(n)給藥前血糖(mmol·L －1)給藥后血糖(mmol·L －1)空白對照組 8 5.62±1.32 5.13±1.06**糖尿病模型組 8 15.31±3.3 17.07±4.7陽性組 8 15.21±3.77 12.36±5.24翻白草總黃酮低劑量組 8 15.34±3.26 10.94±6.07翻白草總黃酮中劑量組 8 15.28±3.32 9.49±4.87*翻白草總黃酮高劑量組 8 15.18±2.86 9.31±5.61*

翻白草總黃酮富集物高劑量組、中劑量組空腹血糖值顯著低于糖尿病模型組(P<0.05);低劑量組空腹血糖值與糖尿病模型組比較無顯著性差異(P>0.05)。

3.2 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠糖耐量 結(jié)果見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠糖耐量(±s)

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠糖耐量(±s)

注:與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

組別例數(shù)(n)血清葡萄糖(mmol·L－1)空白對照組 8 5.13±1.06 8.75±2.41**7.73±3.34**6.04±1.15**糖尿病模型組 8 17.07±4.7 26.32±3.31 23.32±2.83 20.54±3.37陽性組 8 12.35±5.24 22.56±4.55 19.27±3.87 13.31±2.02翻白草總黃酮低劑量組8 10.94±6.07 23.89±2.22 20.54±2.68 15.53±2.98翻白草總黃酮中劑量組8 9.49±4.87 19.09±2.47*16.42±2.51*11.54±3.02*翻白草總黃酮高劑量組8 9.31±5.61 19.19±3.21*16.89±2.54*11.78±2.78*

正常組大鼠血糖于灌胃給與3g·Kg－1葡萄糖0.5h后迅速升高并達(dá)峰值，以后血糖開始下降。模型組大鼠血糖于糖負(fù)荷后持續(xù)升高，雖于2h有所降低，但與糖負(fù)荷前血糖濃度相比變化不大。翻白草總黃酮富集物中、高劑量組在糖負(fù)荷后0.5h達(dá)峰值，血糖升高幅度均明顯小于模型組(P<0.05)，2h后降低至糖負(fù)荷前血糖水平附近，與模型組血糖比較有顯著性差異(P<0.01)，表明翻白草對糖尿病大鼠的糖耐量有改善作用。

3.3 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠血清胰島素水平 結(jié)果見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清胰島素水平(±s)

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清胰島素水平(±s)

注:與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

組別 例數(shù)(n) 血清胰島素(μIU·mL－1)空白對照組 8 8.26±1.92**糖尿病模型組 8 25.75±7.84陽性組 8 16.68±4.84翻白草總黃酮低劑量組 8 17.39±4.25翻白草總黃酮中劑量組 8 15.16±4.08*翻白草總黃酮高劑量組 8 10.34±1.98*

翻白草總黃酮富集物高劑量組、中劑量組血清胰島素顯著低于糖尿病模型組(P<0.05);低劑量組血清胰島素值與糖尿病模型組比較無顯著差異(P>0.05)。

3.4 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠胰島素敏感性指數(shù) 結(jié)果見表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠胰島素敏感性指數(shù)(±s)

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠胰島素敏感性指數(shù)(±s)

注:與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

組別 例數(shù)(n)胰島素敏感性指數(shù)空白對照組 8－3.74±1.72**糖尿病模型組 8－6.08±5.81陽性組 8－5.32±3.74翻白草總黃酮低劑量組 8－5.24±3.15翻白草總黃酮中劑量組 8－4.96±3.18*翻白草總黃酮高劑量組 8－4.56±1.32*

翻白草總黃酮富集物高劑量組、中劑量組胰島素敏感性指數(shù)顯著高于糖尿病模型組(P<0.05);低劑量組空腹血糖值與糖尿病模型組比較無顯著差異(P>0.05)。

3.5 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠超氧化物歧化酶值(SOD)結(jié)果見表5。

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠SOD值(±s)

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠SOD值(±s)

注:與模型對照組比較，*P<0.05。

空白對照組8 378±29.85糖尿病模型組 8 305.68±24.19陽性組 8 311.76±20.15翻白草總黃酮低劑量組 8 321.3±60.7翻白草總黃酮中劑量組 8 350.26±12.29*翻白草總黃酮高劑量組 8 345.05±23.1*

翻白草總黃酮富集物高劑量組、中劑量組SOD顯著高于糖尿病模型組(P<0.05);低劑量組SOD與糖尿病模型組比較無顯著差異(P>0.05)。

3.6 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠MDA值 結(jié)果見表6。

表6 各實(shí)驗(yàn)對大鼠MDA值(±s)

表6 各實(shí)驗(yàn)對大鼠MDA值(±s)

注:與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

組別 例數(shù)(n)MDA(nmol·mL －1)空白對照組 8 5.95±1.13**糖尿病模型組 8 7.62±0.79陽性組 8 6.73±1.14翻白草總黃酮低劑量組 8 7.33±1.03翻白草總黃酮中劑量組 8 6.26±0.91*翻白草總黃酮高劑量組 8 6.45±0.97*

翻白草總黃酮富集物高劑量組、中劑量組MDA顯著低于糖尿病模型組(P<0.05);低劑量組MDA與糖尿病模型組比較無顯著差異(P>0.05)。

3.7 各實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)

空白對照組大鼠(圖1):胰島呈圓形或橢圓型，邊界清晰，胰島細(xì)胞排列規(guī)整;模型對照組大鼠(圖2):胰島明顯萎縮，邊界模糊，胰島細(xì)胞排列紊亂，其數(shù)量較正常對照組明顯減少，并有明顯的細(xì)胞腫脹、壞死現(xiàn)象，細(xì)胞核可見染色不清或深染，有核固縮現(xiàn)象;陽性對照組大鼠(圖3):胰島邊界較清晰，細(xì)胞數(shù)量較模型對照組有所增加，細(xì)胞形態(tài)較好，無明顯細(xì)胞腫脹、壞死，核清晰;翻白草總黃酮低劑量組(圖4)與模型對照組相近，胰島改善程度小;翻白草總黃酮中(圖5)、高(圖6)劑量組大鼠胰島的結(jié)構(gòu)形態(tài)有不同程度改善，胰島邊界較清晰，細(xì)胞數(shù)量較模型對照組增加，其中高劑量組胰島恢復(fù)結(jié)果顯著，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯腫脹壞死，無核固縮現(xiàn)象，接近正常胰島結(jié)構(gòu)。

說明翻白草中、高劑量能修復(fù)胰島組織，表現(xiàn)出促進(jìn)胰島組織再生的作用，且其高劑量效果優(yōu)于陽性藥物。

附圖:

圖1 空白組大鼠胰島組織形態(tài)

圖2 模型對照組大鼠胰島組織形態(tài)

圖3 陽性對照組大鼠胰島組織形態(tài)

圖4 翻白草總黃酮低劑量組大鼠胰島組織形態(tài)

圖5 翻白草總黃酮中劑量組大鼠胰島組織形態(tài)

圖6 翻白草總黃酮高劑量組大鼠胰島組織形態(tài)

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，2型糖尿病的最顯著特征就是胰島素β細(xì)胞分泌缺陷和胰島素抵抗，其在中醫(yī)學(xué)屬于“消渴癥”范疇，病因有飲食損傷、燥熱太甚等說［5］。中藥翻白草，其性味甘、苦、平，有清熱解毒，改善消渴癥狀的功效。研究表明，天然藥物黃酮通過多種機(jī)制發(fā)揮降糖作用［6］，翻白草中主要降血糖有效成分為黃酮類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)表明，翻白草總黃酮富集物通過改善模型大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)揮作用。

實(shí)驗(yàn)組空腹血糖值與模型對照組相比，實(shí)驗(yàn)組(中、高劑量組)經(jīng)翻白草總黃酮治療后，空腹血糖均顯著降低，表明翻白草對糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。實(shí)驗(yàn)組血清胰島素水平與模型對照組相比，實(shí)驗(yàn)組(中、高劑量組)經(jīng)翻白草總黃酮治療后，血清胰島素水平均顯著降低，同時，實(shí)驗(yàn)組(中、高劑量組)胰島素敏感指數(shù)顯著高于模型對照組。表明翻白草能降低糖尿病大鼠的血清胰島素，提高胰島素敏感指數(shù)，減輕胰島素抵抗。

自由基可引發(fā)多種不飽和脂肪酸過氧化而生成過氧化脂質(zhì)(LPO)，其最終產(chǎn)生丙二醛(MDA)能使蛋白質(zhì)、核酸、脂類發(fā)生交聯(lián)，使生物膜發(fā)生變性，細(xì)胞突變、衰老或死亡。體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)為直接清除自由基的酶，可阻斷自由基，促使產(chǎn)生LPO的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞不受自由基的損害。糖尿病大鼠抗氧化防御體系受抑制，自由基產(chǎn)生率大于清除率，而LPO的升高與SOD活性降低呈負(fù)相關(guān)，同時與血糖升高呈正相關(guān)，說明血糖升高與自由基引起的脂質(zhì)過氧化有直接關(guān)系［7，8］。本實(shí)驗(yàn)檢測血清MDA含量及SOD活性結(jié)果:實(shí)驗(yàn)高、中劑量組的血清SOD活性明顯增高，血清MDA含量明顯減少，說明翻白草總黃酮可以提高糖尿病大鼠機(jī)體SOD活性，清除自由基，并抑制脂質(zhì)過氧化作用。

胰島細(xì)胞觀察結(jié)果顯示，翻白草總黃酮中、高劑量組都不同程度修復(fù)胰島β細(xì)胞，表明翻白草具有顯著的修復(fù)胰島組織，促進(jìn)胰島組織再生，從而促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素β細(xì)胞分泌缺陷。

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