小鼠-豬種間體細(xì)胞克隆試驗(yàn)

王利勤,郭慧利,芮 榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095)

小鼠-豬種間體細(xì)胞克隆試驗(yàn)

王利勤,郭慧利,芮 榮*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095)

用3代～5代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)作核供體細(xì)胞,體外成熟培養(yǎng)44 h～46 h、排出第1極體(PbI)的豬卵母細(xì)胞去核后,進(jìn)行小鼠-豬種間核移植操作。Hoechst 33342染色檢查去核效果,去核率為84.2%(27/32)。共培養(yǎng)68枚小鼠-豬種間核移植重構(gòu)胚,其中48枚發(fā)生卵裂,卵裂率為70.6%,13枚胚胎發(fā)育至8-細(xì)胞,發(fā)育率達(dá)27.1%(13/48)。

小鼠;豬;胎兒成纖維細(xì)胞;卵母細(xì)胞;種間核移植

種間核移植是以一種動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞為核供體,顯微注射到另一種動(dòng)物的去核受體卵母細(xì)胞中,通過重編程重新獲得發(fā)育能力。隨著哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技術(shù)的發(fā)展與逐步完善,SCNT已日益成為研究核質(zhì)互作、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)等的有效技術(shù)平臺(tái)。目前,異種核移植研究尚處在探索階段,這一研究對(duì)于促進(jìn)基礎(chǔ)生命科學(xué)發(fā)展,深入了解核質(zhì)關(guān)系,對(duì)于珍稀和瀕危野生動(dòng)物保護(hù)等都有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。1994年,Wakstmundzka M[1]將大鼠體細(xì)胞移植到去核的小鼠卵母細(xì)胞內(nèi),重構(gòu)胚出現(xiàn)發(fā)育阻滯,胚胎阻滯在1-細(xì)胞或2-細(xì)胞期;而將小鼠體細(xì)胞移植到大鼠的去核卵母細(xì)胞內(nèi),則可發(fā)育至5～8-細(xì)胞期,表明核供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的來源不同,有可能對(duì)種間重構(gòu)胚發(fā)育產(chǎn)生顯著的影響。陳大元等[2]報(bào)道了大熊貓-兔種間核移植,通過將大熊貓?bào)w細(xì)胞移植給去核兔卵母細(xì)胞成功獲得囊胚發(fā)育。馮秀亮等[3]也成功獲得人-豬種間核移植囊胚;梅祺等[4]報(bào)道了小鼠-兔核移植研究。李光鵬等[5]將小鼠卵丘細(xì)胞移入豬的去核卵母細(xì)胞后,獲得19.0%的重構(gòu)胚卵裂率,但小鼠-豬種間重構(gòu)胚發(fā)育終止于4-細(xì)胞期。本試驗(yàn)旨在建立小鼠-豬種間核移植程序,以期為進(jìn)一步研究核重編程及核質(zhì)互作機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物為6周齡～8周齡129×ICR雜交小鼠,129品系公鼠由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)李相運(yùn)博士惠贈(zèng),ICR小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCXK(滬)2003-0003;按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑藥品 孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG),天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn);人絨毛膜血清促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG),寧波市激素制品廠產(chǎn)品;杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco's phosphate buffered saline,PBS)采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┡渲?TCM199為GIBCO BRL產(chǎn)品,其他試劑均為SIGMA產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 供體細(xì)胞準(zhǔn)備 選取陰門微紅的供試小鼠,分別于第1天和第3天下午4:30,腹腔注射PMSG和hCG各10 IU作超排處理;注射hCG后次日晨7:00前檢查陰道栓[6],有陰道栓者記為妊娠0.5 d。選取妊娠12.5 d的孕鼠脫臼處死,無菌條件下打開腹腔,暴露子宮,分離子宮系膜,剪斷子宮角,分離出整個(gè)子宮,用添加青霉素、鏈霉素各100單位/mL的PBS洗2次～3次,剪開子宮,取出帶有胎膜的胚胎;用鑷子撕破胎膜,取出胎鼠置于PBS中洗2次～3次;去除鼠胚頭、尾、四肢和內(nèi)臟后,PBS洗3次;將鼠胚軀干剪成1 mm3小塊,以組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2和飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi),獲得原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞記為MEF(0)。隔天換液,每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。MEF(0)生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),先去除培養(yǎng)液,用無血清PBS洗1次～3次,再加入2.5 g/L胰酶1 mL,輕輕搖晃,消化2 min后細(xì)胞變園,部分浮起后即以等體積培養(yǎng)液終止消化;回收細(xì)胞離心洗滌后,按1∶2比例進(jìn)行傳代[7]。按此法傳代培養(yǎng)3代～5代時(shí),取適量細(xì)胞用作核移植供體細(xì)胞。

1.2.2 受體卵母細(xì)胞體外成熟與去核 采用豬體外成熟(in vitromaturation,IVM)卵母細(xì)胞作核移植受體卵母細(xì)胞,IVM方法可參照文獻(xiàn)[8]。簡(jiǎn)言之,采集豬屠宰卵巢,用抽吸法采集直徑2 mm～5 mm卵泡卵母細(xì)胞,實(shí)體顯微鏡下?lián)烊“|(zhì)均勻、包被3層及其以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complex,COC)。COC先用TL-Hepes(臺(tái)氏緩沖液)洗2次,再用 TCM199洗2次作成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液為TCM 199培養(yǎng)液添加 100 mL/L NCS、36 mg/L 丙酮酸鈉、1 mL/L 乳酸鈉、100 mL/L豬卵泡液(porcine follicular fluid,pFF;自 制)、10 IU/mL PMSG 、10 IU/mL hCG 、69 μ g/mL L-半胱氨酸和 1 μ g/mL 17β-雌二醇(17β-E2)、70 mg/L青霉素和 50 mg/L鏈霉素。采用100 μ L微滴法作成熟培養(yǎng),上蓋石蠟油,用前在CO2培養(yǎng)箱預(yù)平衡。

按照本實(shí)驗(yàn)室劇世強(qiáng)[8]報(bào)道的方法進(jìn)行卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)和去核,出現(xiàn)第一極體(first polar body,pbI)者判為卵母細(xì)胞成熟。將成熟卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入1 g/L透明質(zhì)酸酶中,37℃孵育3 min,微吸管輕輕吹打去除卵丘細(xì)胞,撿取裸卵到T L-Hepes液中洗3次,將卵丘細(xì)胞去除干凈。去核時(shí),成熟卵母細(xì)胞與事先準(zhǔn)備的MEF同時(shí)移入操作滴(TCM199-Hepes添加7.5 μ g/mL細(xì)胞松弛素 B)中,于38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡15 min后進(jìn)行去核操作。固定針固定卵母細(xì)胞,使pbI置于1點(diǎn)鐘位置,去核針從3點(diǎn)鐘位置刺過透明帶,吸去pbI及其附近約20%左右的胞質(zhì),等待注射。隨機(jī)選擇部分去核卵母細(xì)胞 ,于 5 μ g/mL Hoechst 33342 TCM199 中孵 育15 min,在熒光顯微鏡下檢查去核效果。

1.2.3 異種重構(gòu)胚構(gòu)建與電激活/電融合 用注核針吸取1個(gè)大小適中、形態(tài)較好、表面光滑的MEF,從去核切口注入卵周隙,輕壓透明帶,使供核細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞質(zhì)膜彼此接觸,便于融合。注射后將重構(gòu)胚移入4 g/L BSA NCSU23培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)1.5 h～2 h后進(jìn)行電融合與電激活。所用參數(shù)為1.5 kV/cm、80 μ s和 1 DC 的優(yōu)化參數(shù)組合[8]。

1.2.4 種間重構(gòu)胚的體外培養(yǎng) 所獲核移植重構(gòu)胚用4 g/L BSA NCSU23培養(yǎng)液洗3次后,移入經(jīng)預(yù)先平衡的500 μ L 4 g/L BSA NCSU23培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度;每天檢查并記錄重構(gòu)胚卵裂與發(fā)育情況。

2 結(jié)果

以小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)為核供體細(xì)胞(圖 1a),排出pbI的豬成熟卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞(圖1b),核移植所用去核卵母細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色檢查(圖1c),去核率為84.2%(27/32)。小鼠-豬種間核移植重構(gòu)胚發(fā)育情況列如表1,共培養(yǎng)68枚種間核移植重構(gòu)胚,其中48枚發(fā)生卵裂,卵裂率為70.6%,13枚胚胎發(fā)育至8-細(xì)胞(圖1d)。

圖1 小鼠-豬種間克隆胚胎的獲得Fig.1 Preparation of mouse-pig interspecies cloned embryos

表1 小鼠-豬種間核移植重構(gòu)胚的體外發(fā)育Table 1 In vitro development of mouse-po rcine interspecies reconstructed embryos

3 討論

迄今為止,種間核移植尚未獲得妊娠足月的哺乳動(dòng)物后代。影響種間核移植的因素很多,除影響核移植的一般因素(如核供體細(xì)胞傳代次數(shù)、受體卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)、顯微操作等)外[8],異種核移植可能需要更多考慮核質(zhì)關(guān)系及其相互作用。

來源不同種屬動(dòng)物的細(xì)胞染色體數(shù)目常不相同,被報(bào)道用于種間核移植的動(dòng)物染色體數(shù)目(2n)分別為豬38、小鼠 40、大熊貓 42、大鼠42、兔 44、牛60、犬78和人46。陳大元等在大熊貓-兔種間核移植時(shí)發(fā)現(xiàn),源自骨骼肌、子宮上皮和乳腺組織的3種核供體細(xì)胞,移植后的融合率相當(dāng),均在50%～55%之間;并證明卵胞質(zhì)使體細(xì)胞核去分化不具有種特異性,哺乳動(dòng)物異種重構(gòu)胚早期發(fā)育的異種細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間是相容的[2]。梅祺等[4]報(bào)道的鼠-兔核質(zhì)雜交總卵裂率為43.1%。不同種屬間進(jìn)行異種核移植時(shí),可能由于親緣差異,導(dǎo)致卵裂結(jié)果的差別;來自同種動(dòng)物的不同核供體細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)重構(gòu)胚發(fā)育的不同差別。由大熊貓骨骼肌、子宮上皮和乳腺組織培養(yǎng)的細(xì)胞,異種核移植后發(fā)現(xiàn)乳腺來源的細(xì)胞所獲囊胚率最高,子宮上皮細(xì)胞次之,而骨骼肌細(xì)胞效果最差,認(rèn)為可能與細(xì)胞的分化程度有關(guān)[2]。在李光鵬等的試驗(yàn)中,以小鼠8-細(xì)胞卵裂球作核供體時(shí),3.2%(2/62)可發(fā)育到8-細(xì)胞期;而用小鼠卵丘細(xì)胞移入去核豬卵母細(xì)胞后,則有19.0%的重構(gòu)胚發(fā)生卵裂,但停滯于4-細(xì)胞期[5]。本試驗(yàn)選用MEF作核供體,鼠豬異種核移植胚卵裂率為70.6%,8-細(xì)胞胚發(fā)育率達(dá)27.1%,明顯高于李光鵬等的試驗(yàn)結(jié)果;這與試驗(yàn)所用方法不同有關(guān),為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

一般情況下,細(xì)胞經(jīng)6次～10次傳代后,其增殖能力會(huì)逐漸衰退,細(xì)胞特性也會(huì)有所改變。同其他細(xì)胞一樣,MEF特性也非一直恒定的,傳代3次～5次就可得到較好的純化;在大約80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代有助于防止細(xì)胞老化;采用處于快速增殖階段的3代～5代MEF作為核供體細(xì)胞,有利于重構(gòu)胚胎發(fā)育[9]。在體細(xì)胞核移植過程中,核供體細(xì)胞核攜帶著自身組織特異性表觀遺傳特征,作為受體的卵母細(xì)胞對(duì)供體細(xì)胞核重編程作用不完全,也是導(dǎo)致體細(xì)胞核移植效率低下的主要原因。供體細(xì)胞與受體胞質(zhì)細(xì)胞周期的協(xié)調(diào)性對(duì)核移植胚胎的發(fā)育具有明顯影響。早期胚胎發(fā)育受貯存在卵母細(xì)胞內(nèi)mRNA和蛋白質(zhì)的調(diào)控(母型調(diào)控),隨著發(fā)育的繼續(xù),它就開始依賴胚胎自身的合子型基因組的調(diào)控(合子型調(diào)控)。因此,重構(gòu)胚的前期發(fā)育主要是受體卵母細(xì)胞的胞質(zhì)占主導(dǎo)作用,而后期則是以核供體細(xì)胞的核物質(zhì)占主導(dǎo)。當(dāng)經(jīng)體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞內(nèi)時(shí),細(xì)胞核發(fā)生去分化,關(guān)閉所有轉(zhuǎn)錄基因,進(jìn)行重編程[10]。異種胞質(zhì)能夠?qū)w細(xì)胞核進(jìn)行完善的重編程,啟動(dòng)體細(xì)胞核基因組有序的表達(dá),從而調(diào)控異種克隆胚胎的全程發(fā)育,這體現(xiàn)了異種核質(zhì)之間的相容性,但是到相斥性占主導(dǎo)時(shí),又會(huì)導(dǎo)致重構(gòu)胚發(fā)育的阻滯。

種間核移植常表現(xiàn)出高流產(chǎn)率及異常表型,是研究核重編程分子機(jī)制、異種細(xì)胞核質(zhì)互作關(guān)系和早期胚胎發(fā)育的理想模型。種間核移植研究也是瀕危野生動(dòng)物保護(hù)的有力工具,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Experiment on Somatic Cell Clone in Mouse-pig Interspecies

WANG Li-qin,GUO Hui-li,RUI Rong

(College of Veterinary Medicine,Nanj ing Agricultural University,Nanjing,J iangsu,210095,China)

Mouse embryonic fibroblasts at 3-5 passages were used as nuclear donor cells and porcine oocytes maturatedin vitrofor 44-46 h with pbI were used as recipients after enucleation.Mouse-pig interspecies nuclear transfer was conducted in the present experiment.The enucleation was examined by Hoechst 33342 staining,resulting in an enucleation rate of 84.2%(27/32).A total of 68 reconstructed embryos derived from mouse-pig interspecies nuclear transfer were culturedin vitroand 48 embryos among which cleavaged,resulting in 70.6%of cleavage rate.13 reconstructed embryos developed into 8-cell stage and the developmental rate reached 27.1%(13/48).

mouse;pig;embryonic fibroblast;oocyte;interspecies nuclear transfer

S814.8

A

1007-5038(2010)01-0027-04

2009-08-29

國(guó)家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(2008AA101003);農(nóng)業(yè)部“十一五”科技支撐計(jì)劃(2008BADB2B11)

王利勤(1985-),女,四川樂山人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物生殖生物學(xué)研究。*通訊作者