豬圓環(huán)病毒1型陰性的PK-15細(xì)胞株的篩選

張春紅,蔣智勇,孫麗華,宋長(zhǎng)緒

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510640)

PK-15是豬腎傳代細(xì)胞系,其父母代源自1955年美國(guó)Stice提供的成年豬腎細(xì)胞PK-2a,后被美國(guó)ATCC收藏(收藏號(hào)為 ATCC-CCL33)[1]。PK-15細(xì)胞現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒等的分離、體外增殖以及多種獸用疫苗的生產(chǎn)。目前影響PK-15細(xì)胞使用的最大問(wèn)題是豬圓環(huán)病毒(PCV)的污染。PCV屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是一種環(huán)狀的單股DNA病毒,基因組大小為1 767～1 768 bp,有 PCV1和PCV2兩種基因型或血清型[2]。PCV2是從患斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的仔豬群中分離到[3],因其對(duì)豬有一定的致病性,受到很多養(yǎng)豬場(chǎng)獸醫(yī)和研究人員的重視。PCV1是1974年由德國(guó) Tischer等從PK-15細(xì)胞中作為一種類似病毒顆粒污染物分離出來(lái),對(duì)豬沒(méi)有致病性[4]。通過(guò)對(duì)PK-15細(xì)胞受PCV1污染的溯源調(diào)查發(fā)現(xiàn),在其被ATCC收藏后不久就可以檢測(cè)出PCV1的污染。然而污染的來(lái)源目前還不清楚,很可能在最初的豬腎細(xì)胞PK-2a中就出現(xiàn),或者可能是當(dāng)初由污染的血清或其他細(xì)胞培養(yǎng)添加物(如豬源胰蛋白酶)攜帶入PK-15細(xì)胞[5]。目前,國(guó)內(nèi)外使用的PK-15細(xì)胞都源自ATCC-CCL33,若用它培養(yǎng)病毒生產(chǎn)疫苗,很可能會(huì)使疫苗受到PCV1的污染,在西班牙商品化的豬偽狂犬病活疫苗中就發(fā)生過(guò)這種情況[6]。雖然PCV1無(wú)致病性,但作為一種潛在污染物還是不可接受的。另外,由于PCV1和PCV2接種PK-15細(xì)胞后,都能持續(xù)感染且不表現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE),在培養(yǎng)這兩種病毒時(shí)會(huì)時(shí)常發(fā)生互相污染的情況;同時(shí)因?yàn)?PCV1和PCV2的ORF1核酸同源性可達(dá)86%,而且兩者ORF1所編碼的蛋白抗原存在交叉,這對(duì)研制PCV2的診斷試劑、疫苗和抗體檢測(cè)等帶來(lái)不利影響[7]。綜上所述,當(dāng)前迫切需要一種無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞。本文介紹了一種通過(guò)有限稀釋克隆來(lái)清除PK-15細(xì)胞中PCV1污染的方法,并結(jié)合半套式PCR篩選出2株P(guān)CV1陰性且能穩(wěn)定傳代的PK-15細(xì)胞,為今后PCV的分離鑒定和疫苗研制等提供了一種更好的細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 試劑 MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶為GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?廣譜型基因組DNA純化試劑盒、DL-2 000 DNA Marker、Premix Taq酶、pMD18-T載體購(gòu)自 TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞株 含PCV1的PK-15細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物 根據(jù)已發(fā)表的的 PCV1中國(guó)分離株BJ-1基因組序列(GenBank號(hào):FJ475129.2),設(shè)計(jì)3條引物。引物 P1(5′-T TCT TTAT TCTGCTGGTCGG-3′)位于 ORF1的303～ 322 bp處,引物 P2(5′-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3′)位 于ORF1的 831～ 851 bp處,引物 P3(5′-GGTACCCGAAGGCCGAT TTG-3′)位于 ORF1 的 916 ～935 bp處。引物P1和P2擴(kuò)增的片段長(zhǎng)1 251 bp,引物P1和P3擴(kuò)增的片段長(zhǎng)1 166 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 含PCV1的PK-15細(xì)胞的有限稀釋培養(yǎng) 用MEM生長(zhǎng)液(含 5%胎牛血清)復(fù)蘇含 PCV1的PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)活細(xì)胞。然后用MEM生長(zhǎng)液稀釋至每毫升含10個(gè)細(xì)胞,分種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.1 mL,置含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),待細(xì)胞克隆長(zhǎng)至孔底面積的 1/3～1/2時(shí),刮取孔中少量細(xì)胞,用于提取細(xì)胞DNA。

1.5 細(xì)胞總基因組的提取 參照“廣譜型基因組DNA純化試劑盒”說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞DNA。

1.6 半套式PCR 采用25 μ L PCR反應(yīng)體系。第一步PCR擴(kuò)增使用P1和P2引物,條件設(shè)置為:94℃預(yù)變性5 min后,按94℃變性1 min,65℃退火1 min,72℃延伸 1 min,共 35個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸7 min。第二步PCR擴(kuò)增使用P1和P3引物,取第一次PCR產(chǎn)物1 μ L作為模板,條件設(shè)置同第一步,但退火溫度為56℃。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將陽(yáng)性條帶回收純化后,連接pMD18-T載體,送上海博亞公司進(jìn)行測(cè)序,所得序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較。

1.7 PCV1陰性的PK-15細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將1.6檢測(cè)為PCV1陰性的PK-15細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),然后按1.4的有限稀釋法繼續(xù)克隆篩選,如此連續(xù)克隆2～3次,至克隆孔100%陰性為止。篩選出的PCV1陰性的PK-15細(xì)胞株,一部分液氮保存,一部分繼續(xù)傳代,并每隔2～3 d傳代1次,連續(xù)傳代 30次,每代抽取少量細(xì)胞按1.5和1.6方法作PCR檢測(cè),以測(cè)定其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 半套式PCR結(jié)果 復(fù)蘇的含PCV1的PK-15細(xì)胞經(jīng)第一次有限稀釋法克隆,得到 70個(gè)克隆,經(jīng)半套式PCR的檢測(cè),其中45個(gè)克隆為PCV1陰性,25個(gè)克隆為PCV1陽(yáng)性。陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在1 166 bp處有一條特異性的條帶,陰性克隆沒(méi)有任何條帶(圖1)。該條帶經(jīng)測(cè)序后與孫麗華等報(bào)道的從PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增的PCV1病毒的ORF1序列(GenBank號(hào):EF493843.1)完全相同,說(shuō)明PK-15細(xì)胞確實(shí)受到PCV1的污染。

圖1 半嵌套式PCR結(jié)果

2.2 PCV1陰性PK-15細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 將第一次PCR檢測(cè)為PCV1陰性的45個(gè)克隆繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d再進(jìn)行第二次PCR檢測(cè),獲得9個(gè)PCV1陰性克隆孔。將這9個(gè)PCV1陰性的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng),再繼續(xù)用有限稀釋法克隆,最終獲得2株P(guān)CV1陰性的PK-15細(xì)胞株(PK-15/B2和PK-15/B5),這2株細(xì)胞分別再用有限稀釋法克隆2次,獲得的克隆孔全為PCV1陰性。另將這2株細(xì)胞分別傳代培養(yǎng),直至30代,每代細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果也均為PCV1陰性。

3 討論

3.1 PCV1可長(zhǎng)期持續(xù)污染PK-15細(xì)胞,但不表現(xiàn)CPE。在有 PCV1污染的 PK-15細(xì)胞中,因?yàn)镻CV1的增殖速度慢,PK-15細(xì)胞的生長(zhǎng)速度快,在快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中會(huì)有少數(shù)細(xì)胞未被PCV1感染,因此可以通過(guò)多種方法進(jìn)行單細(xì)胞的篩選,如軟瓊脂法、顯微操作法和有限稀釋法等。本研究選用相對(duì)簡(jiǎn)單的有限稀釋法對(duì)PK-15細(xì)胞進(jìn)行篩選。

3.2 半套式PCR是利用第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二次PCR擴(kuò)增的模板,而且因?yàn)榈诙蜳CR反應(yīng)中的一個(gè)引物縮進(jìn),使靶DNA序列得到有效的選擇性擴(kuò)增,大大提高了擴(kuò)增的靈敏性和特異性。本研究中在第一次克隆得到的70個(gè)克隆孔中,第一次檢測(cè)有45個(gè)克隆孔為陰性,2～3 d后進(jìn)行第二次PCR檢測(cè),只有9個(gè)克隆孔為陰性。這種在陰性克隆中又出現(xiàn)PCV1陽(yáng)性的原因,可能與半套式PCR檢測(cè)方法的極限度有關(guān)。當(dāng)PK-15細(xì)胞中感染PCV1的細(xì)胞占極少量時(shí),半套式PCR方法不能檢測(cè)到病毒;細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后,病毒得以繁殖,數(shù)量超過(guò)檢測(cè)下限,又能被檢測(cè)出來(lái)。所以,需要經(jīng)過(guò)數(shù)次的克隆和檢測(cè)篩選,才可以獲得穩(wěn)定的不含PCV1的PK-15細(xì)胞。本研究獲得的2株P(guān)CV1陰性的PK-15細(xì)胞,經(jīng)傳代30代次后仍檢測(cè)不到PCV1,說(shuō)明這兩個(gè)細(xì)胞株的遺傳性質(zhì)穩(wěn)定,它們的獲得為臨床分離和鑒定PCV、PCV的抗體檢測(cè)及PCV的疫苗研制等提供了良好的保障。

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