• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新疆石河子地區(qū)犬細(xì)小病毒的分離鑒定與基因型分析

    2010-06-01 01:38:34劉志強(qiáng)張小鶯王光雷趙軍明薄新文王新華鐘發(fā)剛
    中國獸醫(yī)雜志 2010年8期
    關(guān)鍵詞:細(xì)小氨基酸引物

    劉志強(qiáng),張小鶯,黃 新,王光雷,努 爾,趙軍明,薄新文,王新華,鐘發(fā)剛

    (1.新疆建設(shè)兵團(tuán)綿羊繁育基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子832000;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊830000;3.德國柏林洪堡大學(xué)夏洛特醫(yī)學(xué)院藥理所,德國柏林10117)

    犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)是一種引起犬出血性腸炎或心肌炎的病毒[1]。歐洲首先在1976年和 1977年,在美國1978年都鑒定出存在CPV陽性血清.至1979年病例已蔓及世界各地[2-3]。1982年10月,我國報道在暴發(fā)傳染性出血性腹瀉的病犬糞便提取物中,發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒顆粒,其大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)具有典型的細(xì)小病毒特征,從而首次證實(shí)該病在我國的存在[4-5]。隨后,在我國各地陸續(xù)有本病發(fā)生的報道。近年來隨著城市寵物熱的興起,該病廣泛的傳播蔓延。據(jù)石河子市獸醫(yī)防疫站初步統(tǒng)計,在犬的各種傳染病中,犬細(xì)小病毒性腸炎發(fā)病率、死亡率均為最高,為當(dāng)前犬的主要傳染病之一。本實(shí)驗(yàn)室從病死犬的內(nèi)臟中分離到1株犬細(xì)小病毒,初步命名為CPV-SHZ毒株。

    1 材料與方法

    1.1 病料及細(xì)胞 分別采集病死犬的心、肝、脾、小腸及內(nèi)容物。CPV陽性血清(細(xì)小病毒疫苗免疫家兔制備)、F81貓腎傳代細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)。紅細(xì)胞:采集健康豬抗凝的血液,洗滌后配成0.5%紅細(xì)胞懸液備用。

    1.2 主要試劑 RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司),犢牛血清(蘭州民海生物工程有限公司),胰蛋白酶(Amresco),DNA Marker Gene Ruler 100bp DNA Ladder plus、PCR(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),T aKaRa Ex Taq酶[寶生物工程(大連)有限公司]。PCR回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。培養(yǎng)液為10%犢牛血清RPMI~1640,維持液為2%犢牛血清RPMI-1640,消化液為0.25%胰蛋白酶EDTA。

    1.3 引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)表CPV的VP2基因序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計了1對引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    上游引物(C1):5′-GGCAAGCT TATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′

    下游引物(C2):5′-CGCGTCGACTATGT TAATATAAT TT TCT-3′

    1.4 病毒分離 采用同步接種法,同步接種F81貓腎細(xì)胞,24 h后將生長液棄去換上維持液,逐日觀察,待出現(xiàn)明顯的CPE(達(dá)80%)收毒,細(xì)胞長滿單層未出現(xiàn)CPE繼續(xù)傳代,整個過程設(shè)有對照。收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次,4 000 r/min離心30 min,上清液用氯仿處理2次,水相加入聚乙二醇-6 000(PEG),使其終濃度達(dá) 12%,4℃過夜,10 000 r/min離心30 min,沉淀用PBS稀釋,打碎沉淀塊,再次氯仿處理,水相即為病毒濃縮液。

    1.5 病毒純化 病毒濃縮液用Sepharose-4B柱層析,用 0.01 moL/L PBS(pH值 7.2)平衡并洗脫[6-7],分管收集,用電鏡和SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中的病毒。

    1.6 病毒鑒定

    1.6.1 HA及HI試驗(yàn) 按文獻(xiàn)[8-9]方法進(jìn)行。1.6.2 病毒毒力測定 F81細(xì)胞在96孔板上滴定病毒的TCID50。并用5-IUDR處理待鑒定病毒進(jìn)行核酸型鑒定。

    1.6.3 電鏡觀察 按文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行。

    1.6.4 VP2基因的擴(kuò)增 取病毒濃縮液50 μ L隔水煮10 min后離心,上清即為模板。

    PCR擴(kuò)增體系:50 μ LPCR反應(yīng)體系如下:(引物濃度 50 pmol/μ L),ddH2O(29.5 μ L),10 ×PCR Buffer(5 μ L),dNTP(8 μ L),模 板 (5 μ L),C1(1 μ L),C2(1 μ L),Taq 酶(0.5 μ L),PCR 反 應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃1 min,54℃1 min,72℃1.5 min,順序30個循環(huán),72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束,取少量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果,陽性產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6.5 VP2基因的序列分析 應(yīng)用回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)回收PCR產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37℃培養(yǎng)18~24 h,藍(lán)白斑篩選陽性菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp+),37℃培養(yǎng)過夜,分裝送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用序列分析軟件進(jìn)行比較。

    1.6.6 動物回歸試驗(yàn) 選取兩月齡、未注射犬細(xì)小病毒疫苗易感犬5只,2只1組,分別皮下注射和口服途徑接種2 mL CPV細(xì)胞培養(yǎng)物,余下1只隔離飼養(yǎng)設(shè)為對照,攻毒3 d后,每日收集犬腸內(nèi)容物作PCR檢測,逐日觀察各項(xiàng)生理指標(biāo)。

    2 結(jié)果

    2.1 病毒分離結(jié)果 正常的F81細(xì)胞為貼壁生長、均質(zhì)透明的不規(guī)則多邊形(見圖1)。接毒F81細(xì)胞,盲傳3~4代可見特征病變:脫落、變形、游離、拉網(wǎng)(見圖2)。

    圖1 正常的F81細(xì)胞

    2.2 病毒純化結(jié)果 病毒濃縮液經(jīng)Sephrose-4B柱層析后,出現(xiàn) 2個洗脫峰,經(jīng) ELISA和 SDSPAGE電泳測定病毒抗原主要在第二峰,可見兩條清晰的條帶:76 ku的VP1,64 ku的VP2(見圖3),與文獻(xiàn)報道相[10]符合。免疫電鏡觀察結(jié)果(見圖4),可見病毒粒子呈圓形或六邊形,直徑為20~24 nm,多數(shù)為實(shí)心,少數(shù)為空心,表面無囊膜,病毒粒子呈聚集狀態(tài)。

    2.3 病毒鑒定結(jié)果

    2.3.1 HA和HI試驗(yàn)結(jié)果 病毒培養(yǎng)物能凝集豬的紅細(xì)胞,其效價高于2×109,用已知CPV陽性血清可規(guī)律性的抑制其血凝作用。

    2.3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增在1.7 kb處看到1條明亮的條帶,與所設(shè)計目的條帶大小相符合。2.3.3 病毒毒力測定結(jié)果 F81細(xì)胞測定CPVSHZ的TCID50為10-6.0,較加 5-IUDR處理(10-4.0)高3個對數(shù)。說明病毒代謝可被5-IUDR所抑制,其核酸類型屬于DNA型。

    2.3.4 序列分析結(jié)果 將測定核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與 CPV參考株 V154、LCPV-V204、LCPV-V139、LCPV-V203進(jìn)行比較分析。從結(jié)果可看出此次分離到的CPV為2a型。但是其VP2的第970、971、1 694位氨基酸分別發(fā)生了A→T、T→A、G→A的替換。其第424位和564位氨基酸發(fā)生I→V和S→N的替換。

    2.4 動物回歸試驗(yàn) 兩種途徑接種試驗(yàn)動物犬,分別在第3天和第5天出現(xiàn)體溫升高、厭食、精神沉郁、灰白色粥狀樣糞便等臨床癥狀。病犬白細(xì)胞數(shù)減少到6 400個/mm3(未接種前試驗(yàn)犬的白細(xì)胞數(shù)為12 000~13 000個/mm3)左右。發(fā)病后7 d死亡,剖檢可見尸體消瘦,嚴(yán)重脫水,皮膚干燥,有碎屑??梢曫つどn白,眼球凹陷;胃內(nèi)空虛,胃底部黏膜出血;空腸及回腸黏膜充血,腸腔擴(kuò)張;腸內(nèi)容物水樣暗紅色,有特殊的臭味,腸系膜淋巴結(jié)腫脹,腸絨毛明顯萎縮,黏膜脫落。

    3 討論

    3.1 病毒分離 用F81貓腎傳代細(xì)胞增殖CPV出現(xiàn)了明顯的CPE,這與前人的研究結(jié)果[11]相符合。為提高病毒的分離率,在糞便處理時可使用氯仿抽提,并按細(xì)胞培養(yǎng)液的1/20進(jìn)行接種。由于CPV的DNA在復(fù)制時需要處于有絲分裂過程中宿主細(xì)胞某些機(jī)能的輔助[12],采取細(xì)胞培養(yǎng)同步接種病毒,能達(dá)到使病毒良好增殖的目的。

    3.2 病毒鑒定 HA檢測結(jié)果與犬細(xì)小病毒特性相符,并且能被CPV陽性血清規(guī)律性抑制,在日常應(yīng)用中能經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷、可靠的對CPV作出鑒定;免疫電鏡觀察到大小均一、成聚集狀態(tài)的病毒粒子,從形態(tài)上對CPV作以鑒定;根據(jù)犬細(xì)小病毒的基因組設(shè)計特異性寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到相應(yīng)的目的條帶。測序得到犬細(xì)小病毒VP2全基因組序列。序列比較分析,與CPV參考株同源性在99%以上。在分子水平上對CPV作以鑒定。

    3.3 病毒純化 用Sephrose-4B柱層析純化CPV,具有操作簡單、快速的特點(diǎn),可以處理大量的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物,純化的病毒可用作制備診斷抗原和疫苗。3.4 序列比對分析 1978年CPV被發(fā)現(xiàn)至今,先后出現(xiàn)了 5個突變株亞型,即 CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)[13]。Parrish C R等[14]在研究CPV的進(jìn)化時發(fā)現(xiàn),CPV-2a是在1981年取代了自 1978年以來的CPV-2型,而CPV-2b抗原類型在1986年發(fā)現(xiàn)。CPV-2到CPV-2a、CPV-2b,只有幾個堿基發(fā)生了變異,抗原則發(fā)生變異。CPV-2a(2b)VP2的87位、300位氨基酸和305位氨基酸與 CPV-2不同。CPV-2a和CPV-2b只有426位氨基酸不同,426D是CPV-2b特有的[15]。在CPV-2a和CPV-2b的VP2的第300位氨基酸發(fā)生G到D替換,分別命名為 CPV-2c(a)和 CPV-2c(b)[16]。本試驗(yàn)克隆了CPV-VP2基因的1 755 bp,從起始密碼子到1 755 bp處,參照分型標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為CPV-2a型,這與文獻(xiàn)報道目前在我國流行的毒株以CPV-2a占主要地位相符合,這與CPV在意大利、澳大利亞和英國的流行情況相似。分離株在324、424位氨基酸與564位氨基酸突變,這種變異還未見文獻(xiàn)報道,該位氨基酸變化是否引起生物學(xué)特性改變還有待進(jìn)一步研究。

    本試驗(yàn)通過新疆石河子分離株(CPV-SHZ)VP2基因的序列分析,為我國CPV分子流行病學(xué)調(diào)查提供了一定的參考依據(jù),并為進(jìn)一步探討CPV的抗原變異及研制CPV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

    [1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

    [2]孔繁德,陸承平.CPV病原特性的研究概況[J].中國獸醫(yī)科技,1995,25(1):18-20.

    [3]丁壯,徐彥勤.犬細(xì)小病毒腸炎研究進(jìn)展[J].遼寧畜牧獸醫(yī),1997,5:40-41.

    [4]邱薇,范泉水,李作生,等.犬細(xì)小病毒的比較及分型研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(5):69-72.

    [5]吳健敏,閔下沛.犬抗細(xì)小病毒抗體的調(diào)查[J].中國養(yǎng)犬雜志,1995,6(4):9-10.

    [6]馬波,向左云,鐘光祿,等.應(yīng)用凝膠過濾篩選甲型肝炎病毒介質(zhì)[J].中國生物制品學(xué)雜志,2004,17(2):102-103.

    [7]李茂祥,李俊寶,鄭玉美.小鵝瘟病毒純化及其理化特性的研究[J].病毒學(xué)報,1990,6(2):155-159.

    [8]宋珍華,金淮,徐漢坤.犬細(xì)小病的血凝特性的研究[J].中國畜禽傳染病,1998,50(1):5-7.

    [9]朱君,李峰.犬細(xì)小病毒最佳血凝條件初探[J].畜禽業(yè),2005,177(1):57-58.

    [10]Hurtado A,Rueda P,Nowicky J,et al.Identification of Domains in Canine Parvovirus VP2 Essential for the Assembly of Virus-Like Particles[J].Journal of Virology,1996,70(8):5422-5429.

    [11]Parker J S,Parrish C R.Canine parvovirus host range is determined by the specific conformation of an additional region of the capsid[J].Journal of Virology,1997,71(12):9214-9222.

    [12]Parrish C R,Oconnel P H,Evermann J F,et al.Natural varition of canine parvovirus[J].Science,1985,230(4729):1046-1048.

    [13]Battilani M,Ciulli S,Tisato E,et al.Genetic analysis of canine parvovirus isolates(CPV-2)from dogs in Italy[J].Virus Res,2002,83:149-157.

    [14]Parrish C R,Aquadro C F,Strassheim M L,et al.Rapid and genic-ty pe replacement and sequence evolution of canine parvovirus[J].J Virol,1991,65(12):6544-6552.

    [15]Q Qin,Loeffler I K,M Li K,et al.Sequence analy sis of a canine parvovirus isolated from a red panda(Ailurus fulgens)in china[J].Virus Gene,2007,34:299-302.

    [16]Steinel A,Munson L,M Van Vuuren,et al.Genetic characterization of feline parvovirus sequences from various carnivores[J].J Gen Virol,2000,81:345-350.

    猜你喜歡
    細(xì)小氨基酸引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    月桂酰丙氨基酸鈉的抑菌性能研究
    豬細(xì)小病毒感染的防治
    UFLC-QTRAP-MS/MS法同時測定絞股藍(lán)中11種氨基酸
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:05
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    犬細(xì)小病毒病(CPV)的診斷與治療
    一株Nsp2蛋白自然缺失123個氨基酸的PRRSV分離和鑒定
    為善小 傳播愛——樂善好施從細(xì)小處開始
    海峽姐妹(2015年5期)2015-02-27 15:10:46
    欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本一本二区三区精品| .国产精品久久| 午夜福利18| 天堂√8在线中文| 日本 欧美在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产真实伦视频高清在线观看 | a级一级毛片免费在线观看| 久久香蕉精品热| 国产一区二区在线观看日韩| 日本爱情动作片www.在线观看 | 日韩欧美在线二视频| 久久久国产成人免费| av中文乱码字幕在线| 伦理电影大哥的女人| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费电影在线观看免费观看| 长腿黑丝高跟| 亚洲性夜色夜夜综合| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一本久久中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产 | 男女下面进入的视频免费午夜| 18禁在线播放成人免费| 三级毛片av免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 白带黄色成豆腐渣| 一进一出好大好爽视频| 1024手机看黄色片| 欧美潮喷喷水| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费看日本二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 18禁在线播放成人免费| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人午夜高清在线视频| 国产精品女同一区二区软件 | 高清在线国产一区| 亚洲三级黄色毛片| 91狼人影院| 国产视频一区二区在线看| 午夜福利高清视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜老司机福利剧场| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99热这里只有精品一区| 九九爱精品视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 搡老妇女老女人老熟妇| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伦理电影大哥的女人| 日本 av在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久久久久久黄片| 51国产日韩欧美| 看黄色毛片网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国语自产精品视频在线第100页| avwww免费| 日本 欧美在线| 级片在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美日韩乱码在线| av黄色大香蕉| 亚洲电影在线观看av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看舔阴道视频| 日本与韩国留学比较| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品永久免费网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 色哟哟·www| 三级毛片av免费| 国产午夜精品论理片| 美女大奶头视频| 免费人成视频x8x8入口观看| av黄色大香蕉| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 色av中文字幕| 小说图片视频综合网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 春色校园在线视频观看| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人午夜高清在线视频| 久久久精品大字幕| 国产精品无大码| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产 一区 欧美 日韩| 免费在线观看影片大全网站| 免费大片18禁| 亚洲美女搞黄在线观看 | 我的女老师完整版在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩欧美在线二视频| 不卡视频在线观看欧美| 日日撸夜夜添| 99精品久久久久人妻精品| 中文字幕av在线有码专区| 日日啪夜夜撸| 一区二区三区免费毛片| 成人美女网站在线观看视频| 村上凉子中文字幕在线| 日韩高清综合在线| 亚洲午夜理论影院| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精华一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久久久久,| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产男靠女视频免费网站| 男女之事视频高清在线观看| 美女高潮的动态| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久久av| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲国产精品成人综合色| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 天堂网av新在线| 免费av不卡在线播放| 少妇人妻一区二区三区视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日本欧美国产在线视频| 国产av一区在线观看免费| 91在线观看av| 一区二区三区高清视频在线| 99热只有精品国产| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久精品91蜜桃| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本黄色片子视频| 免费观看在线日韩| 国产伦人伦偷精品视频| 免费观看精品视频网站| 日韩精品有码人妻一区| 一级黄片播放器| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲最大成人av| 人妻久久中文字幕网| 动漫黄色视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品亚洲一区二区| videossex国产| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产亚洲av嫩草精品影院| 波多野结衣巨乳人妻| 在线观看一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一本一本综合久久| 亚洲国产精品合色在线| 国产成人福利小说| 久久精品国产亚洲av天美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩高清综合在线| 国产成人一区二区在线| 亚洲自偷自拍三级| 欧美极品一区二区三区四区| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久午夜福利片| 麻豆一二三区av精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 很黄的视频免费| 小说图片视频综合网站| 免费大片18禁| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美性感艳星| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一a级毛片在线观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精华霜和精华液先用哪个| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日本熟妇午夜| 舔av片在线| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产自在天天线| 久久久国产成人免费| 日韩精品中文字幕看吧| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲在线观看片| 精品人妻视频免费看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产免费男女视频| 国产一区二区激情短视频| 老司机福利观看| 精品福利观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 婷婷丁香在线五月| 午夜日韩欧美国产| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 中国美女看黄片| 欧美潮喷喷水| 久久精品人妻少妇| 天美传媒精品一区二区| 观看免费一级毛片| 此物有八面人人有两片| 国产一区二区激情短视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 麻豆一二三区av精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 中国美女看黄片| 国产美女午夜福利| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 韩国av一区二区三区四区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲第一电影网av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久9热在线精品视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av第一区精品v没综合| 99热这里只有是精品在线观看| 天堂影院成人在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲真实伦在线观看| 嫩草影院精品99| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久久久久国产a免费观看| 能在线免费观看的黄片| 91在线观看av| 搡老岳熟女国产| 午夜精品在线福利| 久久久久久久久久成人| 丰满的人妻完整版| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品精品国产色婷婷| 成人亚洲精品av一区二区| 九九在线视频观看精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 嫩草影院入口| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产精品不卡视频一区二区| 91久久精品电影网| 国国产精品蜜臀av免费| 在线看三级毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产美女午夜福利| 特级一级黄色大片| 国产高清激情床上av| 国产精华一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 欧美在线一区亚洲| 国产大屁股一区二区在线视频| 身体一侧抽搐| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产色片| 久久香蕉精品热| 亚洲黑人精品在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产综合懂色| 久久国产乱子免费精品| 国产精品伦人一区二区| 午夜福利18| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品一区二区性色av| videossex国产| 国产精品国产高清国产av| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久中文| 亚洲熟妇熟女久久| 日日夜夜操网爽| 久久中文看片网| 免费黄网站久久成人精品| 精品人妻视频免费看| aaaaa片日本免费| 久久热精品热| 无人区码免费观看不卡| 成人国产一区最新在线观看| 午夜激情福利司机影院| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产精品无大码| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一区二区三区高清视频在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费av不卡在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 天美传媒精品一区二区| 看免费成人av毛片| 欧美在线一区亚洲| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产免费男女视频| 超碰av人人做人人爽久久| 91在线观看av| or卡值多少钱| 亚洲无线观看免费| or卡值多少钱| 国产午夜精品论理片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费观看人在逋| 在线观看舔阴道视频| 亚洲最大成人av| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久国产a免费观看| 欧美在线一区亚洲| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美激情在线99| 又黄又爽又免费观看的视频| 毛片一级片免费看久久久久 | 18禁在线播放成人免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 乱人视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av第一区精品v没综合| av在线亚洲专区| 日韩欧美三级三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久国产成人免费| .国产精品久久| 丝袜美腿在线中文| 欧美最新免费一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲av二区三区四区| 国产精品久久久久久av不卡| 国产视频一区二区在线看| 色播亚洲综合网| 欧美潮喷喷水| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜老司机福利剧场| 成人综合一区亚洲| 日韩精品有码人妻一区| 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 制服丝袜大香蕉在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产中年淑女户外野战色| 一区二区三区激情视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| netflix在线观看网站| 一进一出好大好爽视频| 女人被狂操c到高潮| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久九九精品影院| 成人国产综合亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站| 黄色欧美视频在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| av视频在线观看入口| 18+在线观看网站| 亚洲av免费在线观看| 老司机福利观看| 亚洲精品一区av在线观看| 精品欧美国产一区二区三| h日本视频在线播放| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩精品有码人妻一区| 中出人妻视频一区二区| 波多野结衣高清无吗| 午夜免费激情av| 成人国产综合亚洲| 国产精品女同一区二区软件 | 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美三级亚洲精品| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 黄片wwwwww| 99久久精品国产国产毛片| 国产毛片a区久久久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 精品一区二区三区人妻视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产毛片a区久久久久| 欧美一区二区亚洲| 人人妻人人看人人澡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产成人aa在线观看| 看免费成人av毛片| 久久中文看片网| 很黄的视频免费| 一个人看的www免费观看视频| 久久精品影院6| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 成年女人永久免费观看视频| 99久国产av精品| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av一区综合| 99热这里只有是精品50| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久色成人| 亚洲av五月六月丁香网| 极品教师在线免费播放| 99精品在免费线老司机午夜| 国产不卡一卡二| 国产单亲对白刺激| 97碰自拍视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 在线播放无遮挡| 我的女老师完整版在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 1000部很黄的大片| 日韩av在线大香蕉| 真人做人爱边吃奶动态| 色噜噜av男人的天堂激情| 久99久视频精品免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 制服丝袜大香蕉在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇高潮的动态图| 成人特级av手机在线观看| 中文在线观看免费www的网站| av在线观看视频网站免费| 亚洲四区av| 亚洲av五月六月丁香网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 又黄又爽又免费观看的视频| 十八禁网站免费在线| 91精品国产九色| 国产一级毛片七仙女欲春2| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲在线自拍视频| 一级a爱片免费观看的视频| 能在线免费观看的黄片| 在线观看66精品国产| 嫩草影院精品99| 国产成人a区在线观看| 少妇丰满av| 桃色一区二区三区在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美zozozo另类| 中文字幕高清在线视频| 我的女老师完整版在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 观看美女的网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一区福利在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩综合久久久久久 | 能在线免费观看的黄片| 国产黄片美女视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 男女那种视频在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲国产色片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产视频内射| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 天美传媒精品一区二区| 日韩一区二区视频免费看| 香蕉av资源在线| 成人亚洲精品av一区二区| 日日啪夜夜撸| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av二区三区四区| 免费观看人在逋| 麻豆一二三区av精品| 97超视频在线观看视频| 人妻久久中文字幕网| 神马国产精品三级电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 婷婷亚洲欧美| 欧美性感艳星| 国产av麻豆久久久久久久| 高清日韩中文字幕在线| 色av中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产真实乱freesex| 熟女电影av网| 色播亚洲综合网| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品三级大全| 国产精品一区二区免费欧美| 一区福利在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜精品在线福利| 欧美日韩综合久久久久久 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲 国产 在线| 麻豆成人午夜福利视频| 又紧又爽又黄一区二区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 尾随美女入室| 丰满乱子伦码专区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| www.色视频.com| 亚洲精品456在线播放app | 国内精品宾馆在线| 小说图片视频综合网站| 欧美在线一区亚洲| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美一区二区亚洲| 国产精品人妻久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 真实男女啪啪啪动态图| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品日产1卡2卡| 91av网一区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲最大成人手机在线| 国产一区二区三区视频了| 久久久色成人| 精品一区二区三区人妻视频| 久久九九热精品免费| 99视频精品全部免费 在线| videossex国产| 在线a可以看的网站| 毛片一级片免费看久久久久 | 最好的美女福利视频网| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看av片永久免费下载| 久久午夜亚洲精品久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜老司机福利剧场| 亚洲专区国产一区二区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 又黄又爽又免费观看的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩国内少妇激情av| 最近中文字幕高清免费大全6 | 精品人妻1区二区| 在线看三级毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 韩国av在线不卡| 免费看a级黄色片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av天堂在线播放| 成年免费大片在线观看| 日本与韩国留学比较| 麻豆av噜噜一区二区三区| 午夜福利18| 婷婷丁香在线五月| avwww免费| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 黄色日韩在线| 最近最新免费中文字幕在线| 波野结衣二区三区在线| 欧美黑人巨大hd| 国产极品精品免费视频能看的| 高清毛片免费观看视频网站| 国产老妇女一区| 国产精华一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 国产精品一区www在线观看 | 久久久国产成人免费| 久久精品人妻少妇| 桃色一区二区三区在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 特大巨黑吊av在线直播| avwww免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品电影一区二区三区| 成年女人永久免费观看视频| 18+在线观看网站| 欧美一区二区亚洲| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久|