高效液相色譜法測定金雞片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量

張火旺，謝雄瑞，黃湖斌

（1.廣東省河源市藥品檢驗(yàn)所，廣東 河源 517000； 2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

金雞片由金櫻根、雞血藤、千斤拔、穿心蓮、功勞木、兩面針等6味中藥組成，具有清熱解毒、健脾除濕、通絡(luò)活血的功效，用于治療濕熱下注引起的附件炎。其現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]中只有定性項(xiàng)無含量測定項(xiàng)。為確保制劑質(zhì)量，保證用藥安全有效，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定了該制劑中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型自動(dòng)高效液相色譜儀；日本島津UV-2450型紫外分光光度計(jì)；CP225D型電子天平；SB2200型超聲處理器。甲醇（色譜純，TEDIA），水為超純水；穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品（批號(hào)分別為0797-200105，0854-200103，供含量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所，含量均為100%）；金雞片（市售品，批號(hào)分別為 20080504，20080601，20080701，IA007，依次分別編號(hào)為1，2，3，4）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Hypersil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50）；穿心蓮內(nèi)酯檢測波長：225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的穿心蓮內(nèi)酯對照品10.34 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液；精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品10.13 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液；各用0.45 μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)（過3號(hào)篩），精密稱取適量（約相當(dāng)于2片的質(zhì)量），置50 mL量瓶中，加甲醇適量，密塞，超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備不含穿心蓮的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別取2.2項(xiàng)下3種溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定?？梢?組分的出峰時(shí)間處無干擾峰，表明處方中其他成分及輔料對樣品測定無干擾（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密量取穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品貯備液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置50 mL和25 mL量瓶中，加甲醇至刻度并搖勻，分別配成穿心蓮內(nèi)酯對照品和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定峰面積，以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)、穿心蓮對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為穿心蓮內(nèi)酯 A=25.555 C+0.641 3，r=1.000 0；脫水穿心蓮內(nèi)酯 A=20.234 C-12.099，r=0.999 8。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量分別在 0.020 68～0.124 08 μg和 0.081 04～0.486 24 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的 RSD分別為1.7%和0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，依法平行測定2組分含量。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的 RSD分別為0.63%和0.60%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2 h測定1次。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的 RSD分別為0.71%和0.48%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)為20080504，穿心蓮內(nèi)酯含量為0.635 1 mg/g，平均片重0.325 0 g/片）適量，共6份，分別加入穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液（0.051 35 mg/mL）2，4，5 mL按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣測定含量。精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)為20080504，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為1.166 0 mg/g，平均片重0.325 0 g/片）適量，共6份，分別加入脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液（0.202 6 mg/mL）1，2，3 mL，按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣測定含量。結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，依法測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。根據(jù)4批樣品所測結(jié)果，暫訂金雞片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯總量限為1.0 mg/g。

表2 4批樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，以甲醇為溶劑，經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)掃描，穿心蓮內(nèi)酯在225 nm波長處有最大吸收，而脫水穿心蓮內(nèi)酯在250 nm波長處有最大吸收，靈敏度高，故選225 nm作為穿心蓮內(nèi)酯檢測波長，250 nm作為脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測波長。分別超聲處理樣品 10，20，30，40，60 min，結(jié)果 2 組分含量最高的為超聲30 min，故認(rèn)為超聲30 min基本提取完全。曾以甲醇-水溶液（55∶45）為流動(dòng)相，但樣品的分離度不好，主峰形不好；用甲醇-水溶液（40∶60）為流動(dòng)相時(shí)，主峰分離好，但保留時(shí)間太長，不適合研究；而用甲醇-水溶液（50∶50）為流動(dòng)相時(shí)主峰峰形較對稱，分離效果較好。

4批樣品中，不同廠家、批次的含量相差較大。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本法回收率、精密度、重現(xiàn)性好，可更好、更進(jìn)一步完善金雞片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[1]WS3-B-3432-98，中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第18冊）[S].

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄33.