苯丙哌林緩釋膠囊人體生物等效性研究

陳 梅，鄭 永，魏 來，鄒品文

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）

磷酸苯丙哌林緩釋膠囊為非麻醉性鎮(zhèn)咳藥，其鎮(zhèn)咳作用是可待因的2～4倍，具有起效快、不抑制呼吸、維持時間長、毒副作用小等特點，主要用于治療急性支氣管炎及各種原因引起的咳嗽，對刺激性干咳效果最佳。經(jīng)國家藥品食品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號為2005L02961），受西南藥業(yè)股份有限公司委托，我院臨床藥理基地實施了該公司研制的磷酸苯丙哌林緩釋膠囊的人體生物等效性試驗，以驗證其生物等效性?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括Waters 1525泵、Waters 2487紫外可變波長檢測器、Waters Breeze工作站；WHX微型渦旋混合器（上海躍進(jìn)機械廠）；KL512J型氮吹儀（北京康林科技有限責(zé)任公司）。試驗藥物為西南藥業(yè)股份有限公司研制的磷酸苯丙哌林緩釋膠囊（40 mg/粒，批號為20050901）；參比藥物為湖北中佳藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的磷酸苯丙哌林緩釋片（40 mg/片，批號為050101）；乙腈（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，色譜純）；正庚烷（蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院），三乙胺及異丙醇（重慶川東化工〈集團〉有限公司化學(xué)試劑廠），磷酸二氫鉀（重慶化學(xué)試劑廠），均為分析純；磷酸苯丙哌林標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號為0237-9701）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

選擇18名男性健康志愿受試者，漢族，平均年齡（21.1±1.0）歲，平均身高（173.1±5.6）cm，平均體重（65.2 ±6.7）kg。試驗前所有受試者經(jīng)肝功能、腎功能、血壓、心電圖等檢查均正常，受試前2周未用一切藥物，受試期間禁煙、酒、茶、咖啡和劇烈體力活動；受試前均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過。

2.2 溶液配制

精密稱取干燥至恒重的磷酸苯丙哌林標(biāo)準(zhǔn)品7.8 mg，用適量甲醇溶解，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即為312.0 μg/mL的磷酸苯丙哌林標(biāo)準(zhǔn)貯備液；精密稱取干燥至恒重的安定標(biāo)準(zhǔn)品2.1 mg，用適量甲醇溶解，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即為42.0 μg/mL的安定內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.3 給藥方法及生物樣本采集

將18名受試者隨機分為2組，每組9名，禁食12 h后，于次日晨空腹口服80 mg磷酸苯丙哌林受試藥物或參比藥物，均用200 mL溫開水服下。于給藥前及給藥后 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0，36.0，48.0 h 時抽取前臂靜脈血 3 mL，5 000 r/min離心5 min后分離血漿，將血漿樣本于低溫（-20℃）保存，待測。間隔2周后交換服用另一種藥物，再按上法采集、分離、保存血漿樣本。

2.4 血藥濃度測定

2.4.1 色譜條件及色譜行為

色譜柱：Phenomenex? Gemini C18柱（150 mm ×4.6 mm，5μm），固定進(jìn)樣環(huán)20 μL；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-5%磷酸 - 三乙胺（125 ∶175 ∶10 ∶0.1）[1-3]；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：210 nm；柱溫：25℃。在擬訂的色譜條件下，色譜圖見圖1。可見苯丙哌林、安定與血中內(nèi)源性雜峰分離良好，峰形尖銳，雜質(zhì)和代謝物不干擾藥物的測定。

2.4.2 樣品處理

精密吸取受試者血漿1.0 mL，精密加入質(zhì)量濃度為4.2 μg/mL的安定內(nèi)標(biāo)液 50 μL，加入 2 mol/L 的 NaOH 0.2 mL，旋搖 30 s，再加入3 mL提取液[正庚烷 -異丙醇（95∶5），V/V]，渦旋震蕩1 min，5 000 r/min離心1 min，吸取上層有機層，置尖底試管，70℃水浴氮氣吹干，殘渣用50 μL流動相復(fù)溶，取復(fù)溶液20 μL進(jìn)樣。

2.4.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：在空白血漿中加入質(zhì)量濃度為31.2 μg/mL的苯丙哌林標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血藥濃度分別為461.08，230.54，115.27，57.64，28.82，14.41 ng/mL，按 2.4.2 項下操作測定，記錄色譜圖、樣品峰面積。以苯丙哌林峰面積 A1與安定內(nèi)標(biāo)峰面積 A2的比值 I對苯丙哌林血藥濃度 C進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 C=10.883+323.551I，r=0.997 2（n=6），線性范圍為 461.08～14.41 ng/mL ，最低檢測質(zhì)量濃度為7.71 ng/mL。

回收率試驗：在空白血漿中加入質(zhì)量濃度為31.2 μg/mL的苯丙哌林標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，使血樣的苯丙哌林質(zhì)量濃度分別為461.08，115.27，14.41 ng/mL。按2.4.2項下操作測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出血樣中苯丙哌林的藥物質(zhì)量濃度，將求得的質(zhì)量濃度與已知血藥濃度相比，計算方法回收率，連續(xù)測定5次。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

精密度試驗：取回收率試驗項下高、中、低質(zhì)量濃度的3種溶液，按2.4.2項下操作測定，日內(nèi)測定5次，并連續(xù)測定5 d。結(jié)果高（461.08 ng/mL）、中（115.27 ng/mL）、低（14.41 ng/mL）質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度 RSD分別為6.47%，4.89%，6.07%（n=5），日間精密度 RSD分別為7.93%，8.36%，3.06%（n=5）。

穩(wěn)定性試驗：將質(zhì)量濃度為115.27 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血樣于常溫放置8 h，按2.4.2項下操作測定，結(jié)果0，8 h時的血藥濃度分別為（119.67±18.21）ng/mL 和（117.77±8.89）ng/mL。將質(zhì)量濃度為115.27 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血樣放置于-20℃冰箱中保存，于0，7，14 d時取出血樣，常溫下融凍后，依法測定血藥濃度，血樣測定完后放回冰箱保存，下次融凍再測濃度，結(jié)果7 d和14 d時的血藥濃度分別為（121.98±13.26）ng/mL 和（116.47±10.92）ng/mL。以上結(jié)果表明，血樣在常溫下放置8 h、-20℃冰箱保存14 d均穩(wěn)定。

2.5 藥-時數(shù)據(jù)及藥代動力學(xué)參數(shù)

18名健康男性受試者交叉服用80 mg的苯丙哌林受試藥物及參比藥物后，每位受試者的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用微機3P97程序自動擬合，參考實測值與理論值的相關(guān)系數(shù)（R2）、最大絕對誤差和相對誤差、曲線擬合優(yōu)度及 AIC等指標(biāo)選擇模型。結(jié)果表明，口服苯丙哌林緩釋片或膠囊后，藥-時數(shù)據(jù)符合一室藥代動力學(xué)模型，平均血藥濃度藥 -時曲線見圖2，有關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)及生物利用度見表2。

表2 樣品人體藥代動力學(xué)參數(shù)（X ± s，n=18）

2.6 生物等效性分析

AUC0-48未經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換方差分析結(jié)果顯示，兩藥間無顯著性差異（ P ＞ 0.05），雙單側(cè) t檢驗結(jié)果，t1=2.826≥ t1α=1.746，t2=3.363≥t1α=1.746（等效），90% 置信區(qū)間為 87.0% ～ 109.5% ；經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換方差分析結(jié)果顯示，兩藥間無顯著性差異（P＞0.05），雙單側(cè) t檢驗結(jié)果，t1=3.159，t2=3.897（等效），90%置信區(qū)間為87.5%～109.1%。Cmax未經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換方差分析結(jié)果顯示，兩藥間無顯著性差異（P＞0.05），雙單側(cè) t檢驗結(jié)果，t1=9.500，t2=13.631（等效），90%置信區(qū)間為93.5% ～104.0%；經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換方差分析結(jié)果顯示，兩藥間無顯著性差異（ P＞0.05）；雙單側(cè) t檢驗結(jié)果，t1=9.449，t2=9.594（等效），90%置信區(qū)間為 93.5% ～106.5%。對實測的受試藥物與參比藥物的 Tmax用非參數(shù)統(tǒng)計Wilcoxo法進(jìn)行檢驗，兩藥間無顯著性差異。

3 討論

采用高效液相色譜法測定人體血漿中苯丙哌林質(zhì)量濃度，方法簡便、靈敏、可靠，能夠滿足磷酸苯丙哌林緩釋膠囊人體藥代動力學(xué)和生物利用度研究需要。通過對兩種緩釋制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，顯示兩制劑間無顯著性差異，兩種制劑生物利用度相當(dāng)，即兩制劑生物等效。

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