富硒綠茶對(duì)小鼠部分免疫功能的影響

葉洪平 陳超

茶葉在我國(guó)有數(shù)千年的歷史。綠茶能夠預(yù)防與生活方式有關(guān)的疾病，有延年益壽的作用[1]。茶葉中的主要成分茶多酚更是被作為一種保健品進(jìn)行研究[2]。硒具有防癌抗癌、預(yù)防心血管疾病、延緩衰老等作用[3]。富硒綠茶集綠茶與硒的功效于一身，對(duì)人體有很好的保健防病作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 152只清潔級(jí)昆明系小鼠，雄性，體重18～22g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 富硒綠茶葉 由長(zhǎng)陽縣高山生態(tài)園基地出品并提供,測(cè)硒含量為0.67mg/kg。

1.1.3 儀器與試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-5205型，上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺(tái)，雙人單面100級(jí)清潔級(jí)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)，LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；培育箱，SHELL/JB TC2323，美國(guó)殼牌公司；酶標(biāo)儀，TECAN in finitetm F200，瑞士TECAN集團(tuán)；ConA液，Sigm a CO.USA，5ug/m l；MTT液，Sigm a CO.USA。

1.2 方法

1.2.1 茶葉汁的提取 富硒綠茶50g于燒瓶中，分次加蒸餾水500m l、400m l、400m l，電熱套加熱，保持沸騰狀態(tài)30m in，冷卻無蒸汽后倒出，共煮3次。真空泵抽濾后置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，75℃蒸發(fā)至500m l,茶葉濃度為10%(W/V)。置4℃冰箱中備用，儲(chǔ)存不過3d。

1.2.2 灌胃劑量 LD50的測(cè)定(寇氏法)為9.07g/kg。灌胃濃度低、中、高劑量組分別為每公斤體重1.0g、1.5g、2.0g。

1.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定[4]32只小鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組、對(duì)照組，每組8只。灌胃8d后24h內(nèi)采用椎骨脫臼法處死。超凈工作臺(tái)上，75%酒精消毒皮膚。無菌注射器取含肝素的冷PBS液(肝素的濃度10m g/m l)8m l灌洗腹腔1m in。抽吸出腹腔灌洗液5m l，制成腹腔巨噬細(xì)胞懸液。離心10m in(1500r/m in)。用RPM I1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106/m l。加至96孔板中，每樣本加2孔，100μl/孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h。棄去上清液，一孔加0.075%中性紅溶液100μl/孔，另一孔作為對(duì)照。繼續(xù)孵育30m in。棄去上清液。加入腹腔巨噬細(xì)胞溶解液100μl/孔，置4℃冰箱過夜。置酶標(biāo)儀530nm處，以對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸收度(A值)。

1.2.4 溶血空斑試驗(yàn)[5]40只小鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組、對(duì)照組，每組10只。制備雞紅細(xì)胞懸液[6]和補(bǔ)體[5]。灌胃6d。第6天每只腹腔注射0.2m l2%(v/v)雞紅細(xì)胞懸液。繼續(xù)灌胃4d后頸椎脫臼法處死，無菌取脾。用Hanks液制成細(xì)胞懸液。200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，離心2次(每次10m in，1000r/m in)，將細(xì)胞懸浮在5m l Hank液中。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量的pH 7.4，2倍濃度的Hank液混合，分裝小試管，每管0.5m l。加入用阿氏液配制的10%雞紅細(xì)胞懸液5μl(v/v)。加入20μl脾細(xì)胞懸液，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，凝固，置于CO2培養(yǎng)箱中溫育1.5h，加入阿氏液稀釋的補(bǔ)體(1：10)，繼續(xù)培育1.5h。計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.5 ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)[5]40只小鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組、對(duì)照組，每組10只。灌胃30d后24h采用椎骨脫臼法處死。無菌取脾，置于Hank液中，輕輕磨碎，200目篩網(wǎng)過濾。離心10m in(1000r/m in)。將細(xì)胞懸浮液1m l置于RPM I1640完全培養(yǎng)基中。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)。調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/m l。將細(xì)胞懸液分2孔加入12孔培養(yǎng)板中，每孔1m l。一孔加75μlConA液，另一孔加入培養(yǎng)液75μl作為對(duì)照。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔輕輕吸去上清0.7m l后加入0.7m l不含小牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液。同時(shí)加入M TT液(5m g/m l)50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。出培養(yǎng)箱后每孔加入1m l酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養(yǎng)板中，置酶標(biāo)儀570nm處，以對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定吸收度(A值)。

1.2.6 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)[5]40只小鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組、對(duì)照組，每組10只。每只腹腔注射1m l20%的雞紅細(xì)胞懸液后30m in頸椎脫臼法處死。仰臥固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2m l，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1m in，吸出腹腔洗液1m l。平均分滴于2片載玻片上，放入墊有紗布的搪瓷盒內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱孵育30m in。放入生理鹽水中漂洗、晾干，以體積1：1的丙酮-甲醇溶液固定。用4%Giem sa-磷酸緩沖液染色3m in，蒸餾水漂洗晾干。每張片油鏡下觀察100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)已經(jīng)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，計(jì)算吞噬百分率。

2 結(jié)果

各試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 各試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 各試驗(yàn)結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較，a P 0.05，b P 0.01；與低劑量組比較，c P 0.01，d P 0.05。

組別 吞噬能力(A值) 溶血空斑數(shù)(個(gè)/1×105脾細(xì)胞) 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)吸收度(A值) 吞噬百分率(%) 吞噬指數(shù)(%)對(duì)照組 0.159±0.016 35.4±2.68 0.00244±0.00053 29.5±4.70 0.41±0.08低劑量組 0.194±0.019b 38.4±2.36a 0.00285±0.00028a 33.5±2.90▲ 0.49±0.08▲中劑量組 0.220±0.027bd 41.5±1.50bc 0.00295±0.00030b 34.4±2.60b 0.51±0.07b高劑量組 0.230±0.029bd 42.1±2.32bc 0.00253±0.00046 31.3±4.50 0.44±0.07

結(jié)果表明，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活力測(cè)定顯示低、中、高劑量組與對(duì)照組相較吞噬能力均有顯著提高(P均 0.01)；中、高劑量組與低劑量組相較吞噬能力也有所增強(qiáng)(P 0.05)；中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。溶血空斑試驗(yàn)顯示低、中、高劑量組與對(duì)照組相比較，抗體生成能力均有顯著提高(前者P 0.05，后兩者P 0.01)；中、高劑量組與低劑量組相較抗體生成能力有顯著提高(P 0.01)；中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)顯示低劑量組與對(duì)照組相較，P 0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組與對(duì)照組相較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組與對(duì)照組相較，P 0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明低、中劑量組能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，高劑量組不能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)顯示吞噬百分率和吞噬指數(shù)低、中劑量組和對(duì)照組相較，P值分別為P 0.05、P 0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組與對(duì)照組相較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明低、中劑量組能夠增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，高劑量組不能增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

3 討論

茶葉中含有茶多酚、茶多糖、咖啡堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)和藥理成分，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生綜合的生理調(diào)節(jié)作用[7]。

硒的作用越來越被重視，但我國(guó)成人硒日攝取量?jī)H為26～32μg[8]。通過補(bǔ)充膳食中的硒能顯著降低缺硒人群消化道腫瘤的發(fā)生[9]。富硒綠茶無疑是一條通過食物鏈補(bǔ)硒的安全、經(jīng)濟(jì)、方便、有效的新途徑。富硒綠茶由于具有綠茶和微量元素硒兩者共同的保健作用，很受人們的喜愛。

硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的重要組成部分，在機(jī)體內(nèi)起抗氧化作用。硒能夠增強(qiáng)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，其主要機(jī)制[10]為：通過谷胱甘肽過氧化物酶及其同工酶和其他硒化合物清除自由基；清除活性氧，減少脂質(zhì)過氧化物(LPO)的產(chǎn)生，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化物損害；調(diào)節(jié)細(xì)胞表面或附近的含-SH的化合物，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖與分化，影響免疫應(yīng)答水平；激活淋巴細(xì)胞酶系中的一些酶而加強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能。

綠茶最重要也是最關(guān)鍵的藥理作用是天然抗氧化性及清除自由基的作用，起主要作用的是茶多酚[11]。茶多酚抗氧化的機(jī)制有人概括為[12]：抑制氧化酶系和對(duì)抗氧化酶系的激活作用；直接滅活自由基；絡(luò)合誘導(dǎo)氧化的過渡金屬離子；保護(hù)或再生維生素C、維生素E和GSH；協(xié)同其他抗氧化劑的作用；增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。因此，綠茶也具有免疫調(diào)節(jié)功能，與微量元素硒發(fā)揮協(xié)同作用。

本組試驗(yàn)低、中劑量組短期(10d左右)、長(zhǎng)期(30d)4項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)富硒綠茶有增強(qiáng)免疫功能的作用。高劑量組短期試驗(yàn)有增強(qiáng)免疫的功效，其增強(qiáng)作用并不比中劑量組強(qiáng)(P＞0.05),但長(zhǎng)期試驗(yàn)并不能增強(qiáng)免疫功能。長(zhǎng)期試驗(yàn)中體重的觀察顯示，低、中、高劑量組都能夠顯著抑制體重增長(zhǎng)，以高劑量組最為突出。說明富硒綠茶增強(qiáng)免疫功能的作用并不與劑量呈正相關(guān)，可能與機(jī)體免疫功能被調(diào)節(jié)的幅度受限有關(guān)，也可能與高劑量組體重增長(zhǎng)過于緩慢抵消了免疫增強(qiáng)作用有關(guān)，提示長(zhǎng)期高劑量飲用富硒綠茶可能對(duì)機(jī)體存在潛在的損害。

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