吡柔比星局部消融治療兔移植性VX2肝腫瘤的療效探討

張巍 周石 蔣天鵬 斯光晏 郭劍星 吳曉萍

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，手術(shù)切除是目前治療肝癌的最佳手段，但大多患者在就診時(shí)已處于中晚期，已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，僅有9%～27%的患者適宜手術(shù)。因此對(duì)于大多數(shù)患者來說局部消融（Percutaneus local ablative therapy,PLAT）等方法成為主要選擇[1－3]。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后開展了許多局部消融治療,其主要是在超聲、CT、MRI引導(dǎo)下或直視下穿刺，將治療探頭插入腫瘤病灶內(nèi)，通過物理或化學(xué)效應(yīng)使腫瘤組織壞死，是目前治療肝癌的一種重要的微創(chuàng)治療手段[4-5]。近年有學(xué)者嘗試將化療藥物采用經(jīng)皮注射的方式注射到腫瘤局部，以起到抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡、壞死，同時(shí)降低化療藥所致的副作用。吡柔比星(吡喃阿霉素，Pirarubicin，THP) ，具有毒副作用小，抗癌譜廣泛、活性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此在腫瘤治療中得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)于將其采用局部消融的方法，直接穿刺注射到腫瘤局部來治療肝癌的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^比較吡柔比星（THP）和無水乙醇采用局部消融方法治療兔VX2移植性肝癌的療效,來為臨床肝癌介入治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 VX2荷瘤兔（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），日本大白兔（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），2.5～3kg，雌雄不限。德國(guó)Simmons公司AX Axiom Artis FA血管造影機(jī)，ALOKA Prosound SSD-5000SV超聲儀, 超液化碘油（含碘38%，法國(guó)Guerbet公司），無水乙醇(國(guó)產(chǎn)，分析純)，吡柔比星(THP，深圳萬樂公司)，2.5%戊巴比妥鈉（國(guó)產(chǎn)），VEGF試劑(武漢博士德公司)，SABC試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制作[6-8]將VX2荷瘤兔用2.5%戊巴比妥鈉按1ml/kg體重經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注入麻醉，于劍突下作縱行切口，暴露肝臟腫瘤，切取該包塊邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚肉樣瘤塊，剪成大小相近(1mm×1mm×1mm)的組織塊，置RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉及暴露肝臟同前，用眼科鑷將肝左中葉輕牽拉出體外，將肝左中葉包膜捅一小口，在肝臟內(nèi)打一隧道。用眼科鑷取備用的瘤組織塊植入隧道底部，再用明膠海綿輕壓隧道表面及入口處至徹底止血，縫合切口。術(shù)后給予慶大霉素4萬U/只/日，肌注，連續(xù)三日。兩周后于超聲下觀察證實(shí)腫瘤是否生長(zhǎng)成功,并記錄腫瘤大小、回聲特點(diǎn)及有無液化壞死區(qū)域的出現(xiàn)及范圍、腫瘤的最大徑（a）及最小徑（b），并記錄兔子體重。

1.2.2 動(dòng)物的分組及處理 兩周后經(jīng)超聲檢查后，挑選荷瘤兔，將其分成三組，每組8只。A組為空白對(duì)照組8只，麻醉開腹暴露肝臟腫瘤（方法同前），不做任何治療，后逐層縫合關(guān)腹。B組8只為THP組，將THP和少量超液化碘油混合后，麻醉開腹暴露肝臟腫瘤，以1毫升空針吸取吡柔比星（2mg/kg）與少量超液化碘油混懸液直視下緩慢注入腫瘤中，在X線透視下監(jiān)測(cè)有無逸出到血管中及是否腫瘤充分填充，采取多點(diǎn)注射。最后用明膠海綿徹底壓迫確認(rèn)無出血及藥液逸出后逐層縫合關(guān)腹。C組8只為無水乙醇組，乙醇注射量由腫瘤的最大直徑確定，即腫瘤最大直徑的厘米數(shù)等于無水酒精注射的毫升數(shù)[9-10]。將無水乙醇與少量超液化碘油混合。麻醉開腹暴露肝臟腫瘤，在透視下給予輔助監(jiān)測(cè)，直視下以一毫升空針吸取無水乙醇與超液化碘油混懸液直視下緩慢注入腫瘤中，最后用明膠海綿徹底壓迫確認(rèn)無出血及藥液逸出后逐層縫合關(guān)腹。（圖①②）

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 (1) 一般情況 治療后精神、活動(dòng)、進(jìn)食狀態(tài)、毛發(fā)情況及兩周后兔子體重變化；(2) 治療后兩周超聲下記錄腫瘤大小，腫瘤體積大小按照V=1/2ab2（a為最大徑，b為最小徑），計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)率，腫瘤生長(zhǎng)率（growth rate，GR）=V治療后/V治療前*100%；(3) 處死兔子，10%的福爾馬林固定，石蠟包埋切片，每份標(biāo)本在腫瘤最大層面作2～3張病理切片,光鏡觀察并用圖像采集系統(tǒng)采集圖像。結(jié)合光鏡觀察和采集圖像的測(cè)量,計(jì)算出腫瘤壞死區(qū)域和整個(gè)腫瘤的面積，二者之比即為腫瘤組織壞死率；(4) 組織病理學(xué)表現(xiàn)，包括大體變化，轉(zhuǎn)移情況，HE染色觀察腫瘤及周邊正常肝組織變化，VEGF抗體免疫組化測(cè)定腫瘤區(qū)VEGF表達(dá)強(qiáng)度，VEGF陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為腫瘤胞漿內(nèi)棕黃色顆粒狀染色區(qū)，每張切片先在低倍鏡下全面觀察，選定VEGF表達(dá)最強(qiáng)處，后在高倍鏡下進(jìn)一步觀察統(tǒng)計(jì)。陽(yáng)性結(jié)果判定根據(jù)以下兩方面的總分進(jìn)行判斷：①選染色均勻的陽(yáng)性表達(dá)腫瘤區(qū)域，以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為分級(jí)計(jì)分：0%為0分，＜25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分,＞50%計(jì)為3分。②按染色強(qiáng)度來分：陰性(0分)，淡黃色(1分)，黃色(2分)，棕黃色(3分)。兩個(gè)值相加，0～2分計(jì)為陰性(-)，3～6分計(jì)為陽(yáng)性(+)[11]。以上方法均由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立檢測(cè)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)表達(dá)均采用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)量資料比較采用方差分析。組間差異采用x2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各荷瘤兔均能耐受治療過程,手術(shù)中多數(shù)無水乙醇治療組兔子出現(xiàn)呼吸深快、心跳快，注射量大者明顯。治療后5天內(nèi)無水乙醇組多數(shù)兔子進(jìn)食狀況、活動(dòng)、毛發(fā)狀況均較吡柔比星組及空白對(duì)照組差。5天后空白對(duì)照組兔子出現(xiàn)明顯進(jìn)食差，毛發(fā)脫落及光澤減退，行為遲鈍。8天后吡柔比星組也出現(xiàn)明顯上述情況，這時(shí)三組中相比較空白對(duì)照組最為明顯。各組均出現(xiàn)體重下降，治療后兩周觀察體重變化如表:

2.2 治療后兩周計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)率、壞死率

2.3 組織學(xué)變化

2.3.1 治療兩周后處死兔子，取肝臟腫瘤標(biāo)本，見肝內(nèi)移植性VX2腫瘤呈白色魚肉樣，質(zhì)地硬，呈浸潤(rùn)型生長(zhǎng)。其中空白對(duì)照組中多數(shù)出現(xiàn)肝內(nèi)、大網(wǎng)膜等鄰近器官轉(zhuǎn)移和血性腹水；沿腫瘤最大徑剖開見部分出現(xiàn)液化壞死。無水乙醇組中部分出現(xiàn)腫瘤與鄰近器官粘連，大網(wǎng)膜等鄰近器官有轉(zhuǎn)移，其中有3例出現(xiàn)血性腹水，沿腫瘤最大徑剖開見部分有凝固性壞死，部分腫瘤中心出現(xiàn)液化。吡柔比星組中有2例出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及血性腹水，其余均為巨塊型癌結(jié)節(jié)；沿腫瘤最大徑剖開見部分腫瘤中心出現(xiàn)液化。

2.3.2 HE染色觀察組織學(xué)變化（圖③④⑤⑥）

2.3.3 VEGF抗體免疫組化測(cè)定腫瘤區(qū)VEGF表達(dá)強(qiáng)度（每只兔子在腫瘤邊緣取兩個(gè)點(diǎn)切片），結(jié)果表明THP組的陽(yáng)性率為25.0%(4/16)，無水酒精組的陽(yáng)性率為62.5%(10/16)，采用SPSS11.5軟件包行x2檢驗(yàn)，P＜0.05，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（圖⑦）

表1：

表2：

3 討論

對(duì)肝癌的治療目前早期手術(shù)仍是最佳選擇，但大約80%患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。對(duì)于大多數(shù)患者來說經(jīng)動(dòng)脈灌注化療及局部消融治療成為首選，局部消融治療作為一種微創(chuàng)治療，近些年來獲得迅猛發(fā)展。

自1983年日本學(xué)者Sugiura等首先報(bào)道應(yīng)用經(jīng)皮無水酒精注(percutaneous alcohol injection，PEIT)治療肝癌以來，其在臨床上得到廣泛應(yīng)用。無水乙醇主要通過使細(xì)胞脫水、蛋白質(zhì)變性發(fā)生凝固性壞死，繼而發(fā)生纖維化，另外進(jìn)入腫瘤血管使內(nèi)皮細(xì)胞壞死，血小板聚集，微血栓形成，造成腫瘤缺血性壞死[5-9]。但是PEIT需要多次注射才能發(fā)揮療效。 此外，較大的腫瘤組織內(nèi)多有纖維分隔，質(zhì)地不均勻，影響乙醇擴(kuò)散，這樣就影響了對(duì)于較大腫瘤的治療效果，同時(shí)也增加了治療副反應(yīng)。另外對(duì)于乙醇過敏的患者不適合行乙醇注射治療[12－13]。

圖① 開腹見肝左中葉有魚肉樣腫瘤組織呈浸潤(rùn)型生長(zhǎng)

圖②開腹在直視下向瘤內(nèi)注射無水酒精（吡柔比星）與碘油的混懸液，透視下監(jiān)測(cè)，盡可能充填瘤體，避免逸出到血管內(nèi)

圖③ 鏡下見癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，與周圍組織分界不清，細(xì)胞核大而濃染，核分裂象多見。(HE×100)

圖④ 鏡下見腫瘤病灶發(fā)生凝固性壞死,細(xì)胞核濃縮、碎裂、溶解，病灶周圍均有殘余癌巢((HE×100)

圖⑥在無水酒精組中,可見腫瘤周圍正常肝組織凝固性壞死，肝細(xì)胞輪廓尚存，細(xì)胞核濃縮、碎裂、消失，壞死邊緣見明顯充血出血帶((HE×100)

圖⑤ 鏡下見腫瘤周圍肝組織中見肝細(xì)胞脂肪變性((HE×400)

圖⑦ VEGF表達(dá)陽(yáng)性，胞漿內(nèi)較多棕黃色顆粒。

近年來不少學(xué)者嘗試將化療藥物采用經(jīng)皮注射的方式注射到腫瘤局部，以起到抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)其細(xì)胞調(diào)亡、壞死。理論上來說，瘤內(nèi)注射細(xì)胞毒藥物可獲得局部藥物高濃度，但是，藥物很快進(jìn)入血循環(huán)而不能達(dá)到高濃度的目的。目前臨床上許多學(xué)者采用將碘油做為載體，化療藥與碘油混合后在腫瘤局部緩慢釋放作用，這樣一方面便于術(shù)中監(jiān)測(cè)和術(shù)后復(fù)查，另一方面藥物可以在腫瘤局部較好的發(fā)揮作用來殺滅腫瘤細(xì)胞[14]。在肝癌治療中蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素一直是重要的抗腫瘤藥。但由于阿霉素(ADM)等蒽環(huán)類藥物可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損害，使其在臨床應(yīng)用上受到限制。自1979年日本的梅澤濱夫等報(bào)道了阿霉素衍生物吡柔比星(吡喃阿霉素，pirarubicin，THP)，具有毒副作用小，抗癌譜廣泛、活性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此THP在肝癌治療得到了廣泛應(yīng)用。

在對(duì)淺表移行細(xì)胞癌的治療研究中發(fā)現(xiàn)，用THP膀胱內(nèi)滴注與ADM相比較，膀胱內(nèi)滴注后，膀胱癌移行上皮暴露于局部高濃度藥物中，THP更有能力穿透細(xì)胞而引起更多的吸收，產(chǎn)生更強(qiáng)的效應(yīng)。局部用藥大大提高了腫瘤中藥物濃度，最大程度發(fā)揮抗癌作用，促使癌細(xì)胞壞死，瘤體內(nèi)豐富的血管閉塞，組織液化壞死，纖維組織增生。因此根據(jù)THP細(xì)胞滲透作用強(qiáng)，局部給藥方式則可使瘤體內(nèi)藥物濃度增高，抗癌作用強(qiáng)，而且由于仍有小劑量藥物彌散出瘤體，故對(duì)周圍小衛(wèi)星結(jié)節(jié)亦有同樣的作用，可起到區(qū)域性化療的目的[15]。

本實(shí)驗(yàn)中我們將無水乙醇和THP分別與超液化碘油混合到一起，這樣一方面可以通過透視觀察注藥的范圍，另一方面THP與碘油混合后，可以提高局部藥物濃度，在局部持續(xù)的發(fā)揮作用，能夠更好地殺滅腫瘤，對(duì)其周圍的衛(wèi)星瘤灶也有殺滅作用[15]。從實(shí)驗(yàn)過程來看，THP治療組在治療后8天內(nèi)的進(jìn)食、活動(dòng)反應(yīng)、毛發(fā)方面優(yōu)于無水酒精治療組。且治療后兩周體重下降幅度小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。探討其原因考慮是因?yàn)闊o水酒精注射后有較大的刺激性，另外少量的滲漏也會(huì)刺激肝包膜等，注射后兔子反應(yīng)較大，術(shù)中可見兔子的呼吸、心率加快。臨床上為達(dá)到充分消融，我們常將腫瘤周圍正常的肝組織也進(jìn)行消融，對(duì)肝功能損傷較大。實(shí)驗(yàn)中為充分消融我們采用多點(diǎn)注射，這樣注射量需要加大，所產(chǎn)生的副作用也大，并且藥液從針道滲出的機(jī)會(huì)就大大增加。從處死動(dòng)物后標(biāo)本的肉眼和鏡下觀察看到對(duì)正常肝組織也有損害，腫瘤邊緣正常肝組織也出現(xiàn)壞死，引起肝功能的損傷較大。另外無水乙醇注射也會(huì)對(duì)周圍臟器有所損害，因?yàn)闀?huì)有少量的無水乙醇從注射的針眼中滲出，會(huì)損害周圍臟器。從實(shí)驗(yàn)中我們也看到部分兔子治療后解剖觀察出現(xiàn)了與周圍臟器如胃、大網(wǎng)膜等粘連，而且這些粘連又為腫瘤的轉(zhuǎn)移增加了機(jī)會(huì)。另外由于腫瘤間有纖維分隔，影響酒精在腫瘤內(nèi)的彌散，難以達(dá)到充分消融，所以會(huì)有殘留癌灶，會(huì)使腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)。臨床上為達(dá)到良好的治療效果，常需要對(duì)患者采取多次、重復(fù)注射，在本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由于兔子的耐受情況不能多次手術(shù)，我們兩組動(dòng)物均采用了一次注射，但比較其療效是有意義的。THP通過碘油為載體在腫瘤局部緩慢發(fā)揮作用，而在全身其他臟器的血藥濃度很低，并且其性質(zhì)溫和，彌散性好，因此所引起的全身副作用也就大大降低，從而THP組兔子的進(jìn)食、反應(yīng)等一般情況要好的多。另外因?yàn)門HP在局部發(fā)揮作用，對(duì)腫瘤周圍包括我們看不到的衛(wèi)星灶也有殺滅作用，因此我們治療后14天解剖后看到THP組大多為孤立的巨塊型肝癌，周圍的轉(zhuǎn)移灶較無水酒精組少。同時(shí)，治療后無水酒精組的進(jìn)食、活動(dòng)、體重等下降程度大于THP組。

另外在治療中通過超聲觀察無水酒精治療后腫瘤血供較治療前明顯減少，這符合無水酒精的消融原理，注射無水酒精后立即發(fā)生凝固性壞死。治療兩周后病理檢查顯示腫瘤的壞死率略優(yōu)于THP治療組，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在腫瘤生長(zhǎng)率方面無水酒精組仍大于吡柔比星治療組，我們考慮原因?yàn)槟[瘤間有較多的纖維分隔，限制了腫瘤的彌散，從而對(duì)消融效果造成了影響，另外無水酒精消融需要多次消融才能取得較好的效果，而由于兔子的耐受情況，本實(shí)驗(yàn)中無法對(duì)兔子進(jìn)行多次消融，造成了殘留癌灶進(jìn)一步的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，影響了治療效果。THP組中治療后血供減少不明顯，但是其能造成腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長(zhǎng)，這是由其抗癌機(jī)制決定的，THP能直接嵌入DNA雙鍵或抑制DNA聚合酶，抑制DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，在G2期中止細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，另外THP通過碘油為載體在腫瘤局部緩慢發(fā)揮作用，雖然治療中會(huì)有少量的藥物滲出，但是其依然對(duì)腫瘤周圍的衛(wèi)星灶其到殺滅作用。另外我們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)果表明THP治療組的VEGF表達(dá)強(qiáng)度弱于無水酒精治療組，這又為我們對(duì)THP抑制腫瘤生長(zhǎng)提供了一個(gè)線索。

VEGF是一種多功能細(xì)胞因子，能選擇性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的兩種酪氨酸激酶受體，它具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建，內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶和組織因子表達(dá)。這樣VEGF降解血管內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)、削弱血管的屏障作用，致使新生血管基底膜缺損加重，更利于癌細(xì)胞的進(jìn)入，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。研究表明[16-20]：VEGFmRAN的表達(dá)在肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中起著重要的作用；VEGF基因的表達(dá)水平與腫瘤血管染色, 腫瘤的增殖性及門靜脈癌栓的形成呈正相關(guān)；血清VEGF水平可能是HCC轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中因?yàn)槟[瘤中心大多為壞死，所以我們?nèi)∧[瘤邊緣組織測(cè)定VEGF表達(dá)的陽(yáng)性率，通過比較我們發(fā)現(xiàn)THP治療組的VEGF表達(dá)強(qiáng)度弱于無水酒精治療組。相應(yīng)的THP組腫瘤的生長(zhǎng)率要小于無水酒精治療組。另外通過大體觀察，在大網(wǎng)膜等鄰近器官轉(zhuǎn)移及血性腹水的出現(xiàn)機(jī)會(huì)方面要少于無水酒精治療組。而無水乙醇組則對(duì)VEGF水平的下調(diào)作用不是很明顯。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，我們認(rèn)為THP具有下調(diào)VEGF的表達(dá)水平的作用，此可以認(rèn)為是THP抑制腫瘤生長(zhǎng)的原因之一。

4 結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)我們看到，THP作為一種有效的抗肝癌的化療藥通過局部消融治療兔移植性VX2肝腫瘤，在抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、下調(diào)VEGF表達(dá)水平方面表現(xiàn)出一定的效果。但是本實(shí)驗(yàn)僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，其有些發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在臨床中我們可以將其用來治療少血供性肝癌、經(jīng)供血?jiǎng)用}注入藥物困難和經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞后尚有部分區(qū)域藥物沉積不理想的患者。

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