豬流感病毒聚合酶PB1蛋白亞細胞定位的研究*

王曉杜,陳培君,沈 陽,馬志永

(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

豬流感病毒聚合酶PB1蛋白亞細胞定位的研究*

王曉杜,陳培君,沈 陽,馬志永*

(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

豬流感病毒PB1蛋白在其復制中起著轉錄作用,是病毒復制所必需的蛋白?？寺×素i流感病毒的PB1基因,構建重組真核表達載體p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂質體轉染Vero細胞后,分別用Western blot和IFA檢測重組蛋白FLAG-PB1蛋白的表達,結果表明重組蛋白能在真核細胞中得到表達,其亞細胞定位為細胞核表達,與其功能密切相關,為以后流感病毒的相關研究打下了基礎。

豬流感病毒;PB1蛋白;亞細胞定位

流感病毒屬于正黏病毒科負鏈RNA病毒,自從1918年發(fā)生西班牙大流行以來,在全世界多次出現(xiàn)大流行,2009年發(fā)生在墨西哥的甲型H1N1流感病毒,是含有豬源流感病毒的三元重配病毒,已經(jīng)傳播到世界各地,2009年6月12日世界衛(wèi)生組織把警戒級別提高至6級,預示著流感的再次大流行,感染對象由老人和兒童轉向對青壯年的高致病性,在流行病學上的變化,進一步體現(xiàn)了流感病毒的強變異性。研究流感病毒的復制機制,尋找預防和治療流感的疫苗和藥物,是當務之急。流感病毒的復制是3個P蛋白和NP蛋白形成復制酶復合物,相互協(xié)同作用發(fā)揮RNA的復制作用,同時可以與病毒基因組RNA結合形成RNP,是病毒復制和包裝所必需的[1]。單一決定3個聚合酶基因的毒力是非常困難的,但是不同物種來源的病毒聚合酶基因,其物種復制能力有較大差異,這些可能是流感病毒跨物種傳播的機制之一。

流感病毒的PB1蛋白由病毒基因組片段2編碼,由757個氨基酸組成,具有聚合酶活力的蛋白。病毒的RNA聚合酶是由PB1、PB2、PA蛋白形成的異源三聚體,所有的3個亞基都是病毒復制所必需的[2]。其中PB2亞基能綁定真核細胞的mRNA帽子結構,并剪切下帽子連作為病毒轉錄所需的引物[3]。PB1蛋白主要執(zhí)行是聚合酶的功能,合成病毒所需的3種 RNA,即(v)RNA、(c)RNA、mRNA[4]。該蛋白帶有兩個必需的核定位序列,推測可能定位在核內(nèi),發(fā)揮其功能[5]。既然PB1蛋白具有復制酶的功能,那么其在抗病毒藥物靶標分子的研究中具有重要作用,同時也應該在跨種間傳播中發(fā)揮重要功能。本研究克隆豬的H3N2亞型流感病毒PB1基因全長CDS區(qū),真核表達PB1蛋白,間接免疫熒光觀察PB1蛋白的亞細胞定位,為利用PB1蛋白作為抗病毒藥物靶標分子的研究,以及研究流感病毒入侵宿主后的機制等相關工作做了前期研究。

1 材料與方法

1.1 材料

豬流感病毒(Influenza A/Swine/Jiangsu/2/2006/H3N2)、大腸埃希菌 DH5α、Vero 細胞、MDCK細胞、真核表達質粒p3xFLAG-7.1由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存和提供。AMV反轉錄酶、PCR擴增用Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、T載體試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。質粒抽提和DNA片段回收試劑盒購自博大泰克生物技術公司。DMEM和胎牛血清購于Gibco公司。lipofectamine-2000購于invitrogen公司。羊抗小鼠FLAG抗體購于Sigma公司。H RP標記的羊抗小鼠二抗和FITC標記羊抗小鼠熒光二抗購自Santa Cruz公司。ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與真核表達質粒的構建 流感病毒感染MDCK細胞12 h后,提取細胞總RNA,利用Hoffman通用引物[6]作為反轉錄引物,AMV酶反轉錄合成cDNA。PB1的CDS區(qū)引物:PB1-F:5′TATGTCGACATGGATGTCAATCCG3′;PB1-R:5′CAGGGATCCCTATT T TTGCCGTCT3′。RT-PCR擴增出大約2 300 bp的條帶,利用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切亞克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表達載體上,PCR和酶切鑒定獲得陽性克隆。

1.2.2 Western blot檢測PB1的真核表達 構建好的重組質粒p3xFLAG-CMV-7.1-PB1經(jīng)大提試劑盒純化后,測定質粒濃度。根據(jù) lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書的操作步驟,轉染2 μ g質粒進3×105個細胞中,同時轉染 p3xFLAG-CMV-7.1空載體和p3xFLAG-CMV-7.1-M1質粒作為對照。轉染24 h后,收集細胞樣品,細胞裂解總蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉膜后,一抗用小鼠抗FLAG抗體,二抗采用羊抗小鼠H RP,利用ECL發(fā)光試劑盒進行顯色。

1.2.3 間接免疫熒光進行PB1蛋白的亞細胞定位Vero細胞在飛片上長成單層,然后轉染p3xFLAG-CMV-7.1-PB1真核表達質粒(操作按試劑盒說明書進行),經(jīng)甲醛和甲醇(1∶1)固定,一抗用小鼠抗FLAG抗體,二抗用羊抗小鼠FITC標記的熒光抗體,正置熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 真核表達質粒酶切鑒定結果

RT-PCR擴增出 PB1基因全長 CDS區(qū),大約2 300 bp,亞克隆至真核表達載體p3xFLAG-CMV-7.1中,轉化大腸埃希菌DH5α,挑克隆后小提質粒,用SalⅠ和BamHⅠ雙酶酶切鑒定(圖1)。同時測序,鑒定結果與NCBI上公布的SIV序列99%同源性。

圖1 p3xFLAG-CM V-7.1-PB1酶切鑒定Fig.1 Identification of p3x FLAG-CMV-7.1-PB1 plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 Western blot檢測PB1的真核表達

重組載體p3xFLAG-CMV-7.1-PB1轉染Vero細胞,收取細胞總蛋白樣品,以FLAG抗體做一抗Western blot檢測PB1的表達(圖2),以p3xFLAGCMV-7.1-M1作為對照,actin抗體顯色作為上樣量的參照,結果顯示在90 ku大小左右有一條特異帶,證明該蛋白在真核細胞中得到表達。

圖2 Western blot檢測重組蛋白FLAG-PB1的表達Fig.2 The expression detection of recombinant protein FLAG-PB1 by Western blot

2.3 PB1蛋白的亞細胞定位

真核表達質粒 p3xFLAG-CMV-7.1-PB1轉染Vero細胞,甲醛固定后,一抗用小鼠抗FLAG抗體,做好飛片后,在熒光顯微鏡下拍照(圖3),結果顯示綠色代表重組蛋白FLAG-PB1,其表達主要在細胞核內(nèi),藍色顯示的是細胞核。

3 討論

圖3 重組蛋白FLAG-PB1的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of recombinant FLAG-PB1 protein

本研究利用帶FLAG標簽的真核表達載體在真核細胞Vero中表達,Western blot結果表明建立PB1蛋白真核表達系統(tǒng),間接免疫熒光結果表明PB1蛋白在真核細胞的細胞核內(nèi)表達,與以前研究人流感病毒該蛋白結果一致,是與其發(fā)揮復制酶功能密切相關,為下一步流感復制機理的研究做了前期工作。1956年和1968年流感病毒就是因為禽流感病毒PB1片段的替換引起病毒復制效率大大提高,造成毒力上升,致病性增加[7]。高致病性禽流感病毒H5N1其PB1蛋白與病毒復制效率密切相關,是一個重要的毒力因子[8]。近來在流感病毒單個基因替換的研究中發(fā)現(xiàn)PB1蛋白與病毒毒力密切相關[9],為研究流感病毒的毒力因子打開了另一扇大門,也為防控流感病毒探索了新的研究方向。流感病毒復合酶是一個異源多聚體組成,其中PB1、PB2、PA按照1∶1∶1組成發(fā)揮轉錄作用。PB1蛋白具有RNA依賴RNA聚會酶的結構模式,已經(jīng)驗證其幾個主要的結構域,其N端80個氨基酸是與PA亞基密切相互作用的結構域,C端則負責與PB2結合,其中506位點和659位點對這種結合也是非常關鍵位點[10]。其綁定病毒vRNA的區(qū)域也在近期得到了驗證[11],這些研究為揭開流感病毒復制機制奠定了良好的基礎。

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Subcellular Localization of Swine Influenza Virus PB1 Protein

WANG Xiao-du,CHEN Pei-jun,SHEN Yang,MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Shanghai,200241,China)

PB1 protein of influenza virus plays an important role in virus replication.In this paper,the swine influenza virus PB1 gene was cloned into eukaryotic expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1,the recombination expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1-PB1 was transfected into Vero cells by liposome,the expression of FLAG-PB1 was detected by Western blot and IFA.The result showed that the protein was expressed in eukaryotic cell and its subcellular locus is in nucleus,which is association with its function.The result provides a basis for influenza virus research.

Swine influenza virus;PB1 protein;subcellular localization

S852.659.5;S858.28

A

1007-5038(2010)01-0021-03

2009-07-09

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2007JB02);上海市浦江人才計劃項目(07pj14109)

王曉杜(1973-),男,湖北紅安人,博士研究生,主要從事病毒與細胞相互關系研究。*通訊作者