添加載銀納米TiO2對硅橡膠抗菌性能及生物相容性的影響

陳良建，黃冬梅，張思慧，袁劍鳴

(中南大學 湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙，410013)

贗復體修復上頜骨缺損一般是在術后 3～6月進行，這段時期對缺損區(qū)未做修復治療，嚴重影響了患者的面容、言語、吞咽等功能，生活質(zhì)量下降，不利于患者的早期康復和身心健康[1-2]；因而，解決上頜骨切除術后早期修復很有必要。醫(yī)用硅橡膠是常用的假體植入材料，生物相容性好，質(zhì)地柔軟且富有彈性，能利用缺損區(qū)的組織倒凹獲得固位，是上頜骨切除術后早期修復材料的首選。但硅橡膠存在如下不足：表面親水性差，與機體的親合力差，材料表面拋光打磨困難，易發(fā)生細菌和真菌附著[3-4]，作為早期修復材料，可能增加口腔感染的機會，對傷口愈合不利。有學者采用添加抗菌藥物、短時間藥物浸泡等方法[3,5]對硅橡膠進行表面處理，提高硅橡膠的抗菌性，但上述處理只是短時間內(nèi)有效，且易產(chǎn)生耐藥性，臨床應用受限。載銀納米TiO2抗菌效果好、安全性高，是一種具有長效性的無機抗菌劑[5]，在醫(yī)用硅橡膠中添加載銀納米TiO2有望成為改善其抗菌性能的一種方法。本文作者在醫(yī)用硅橡膠中添加不同量的載銀納米TiO2，探討添加載銀納米 TiO2對硅橡膠的抗菌性能及生物相容性的影響，以便為研制上頜骨缺損早期贗復體修復提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為：粒徑為20～80 nm的載銀納米TiO2，其形貌如圖1所示；醫(yī)用高溫硫化硅橡膠(江陰市國光硅橡膠制品有限公司生產(chǎn))；金黃色葡萄球菌標準株(中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科提供)；小鼠成纖維細胞L929(中南大學湘雅中心實驗室提供)。

圖1 載銀納米TiO2 TEM形貌Fig.1 TEM image of Ag-embedded nano-TiO2

1.2 試樣制備

常溫下將載銀納米 TiO2按質(zhì)量分數(shù) 0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和 2.5%分別加入醫(yī)用高溫硫化硅橡膠混合物中，制成厚約1.5 mm的樣品，放入真空干燥箱中高溫硫化(溫度約140 ℃，1.0～1.5 h)制備成長×寬×高為10 mm×10 mm×1.5 mm的硅橡膠試樣，超聲清洗，分組密封裝袋，滅菌后備用。

1.3 性能檢測

1.3.1 添加載銀納米 TiO2硅橡膠抗菌性能(浸漬培養(yǎng)法)

用接種環(huán)從培養(yǎng)基中取少量金黃色葡萄球菌，加入無菌生理鹽水中，制成含菌濃度為1×105CFU/mL的菌液。采用浸漬培養(yǎng)法測定添加載銀納米TiO2后硅橡膠的抗菌性能，將樣品浸泡在5 mL菌液中，空白對照組采用不加任何樣品的菌液；陽性對照組菌液中含載銀納米TiO2粉末。在(37±1) ℃培養(yǎng)5～8 h后，各組取20 μL菌液接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，在(37±1) ℃培養(yǎng)48 h后，進行菌落計數(shù)。以上試驗設置3組平行組，結果取平均值。將測定的菌落數(shù)按下式計算抗細菌率：

式中：r為抗細菌率，%；b為空白對照平均菌落數(shù)；c為添加抗菌劑的樣品平均菌落數(shù)。

1.3.2 添加載銀納米TiO2硅橡膠細胞毒性實驗

根據(jù)抗菌實驗結果，采用含0%和2% TiO2的樣品進行細胞毒性(MTT法)實驗。

將TiO2含量為0%與2.0%的樣品按表面積與浸提介質(zhì)體積比(S/V)為1 cm2/mL浸泡于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中浸提72 h，收集浸提液并于4 ℃保存。

將L929細胞按5 000個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d。分別設材料組、陰性對照組和陽性對照組進行實驗，材料組采用100%，50%和10%濃度的材料浸提液；陰性對照組為含 10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基；陽性對照組為0.064%苯酚溶液。每組設6個復孔進行實驗。棄原培養(yǎng)液，分別加入200 μL上述實驗組培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。采用MTT法用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為490 nm 處測量各孔的光密度 OD490，并進行統(tǒng)計學分析。

1.3.3 添加載銀納米 TiO2硅橡膠對成纖維細胞黏附功能的影響

調(diào)整細胞濃度為 1.5×104個/mL，用加樣器取 2 mL細胞懸液分別接種于含0%與2.0% TiO2的樣品的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每樣本設5復孔，然后于5% CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h，最后，用2.5%戊二醛固定，將硅橡膠樣品置于環(huán)境掃描電子顯微鏡下檢測成纖維細胞在含0%和2.0% TiO2的樣品表面的黏附形態(tài)。

2 結果

2.1 添加不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠的抗菌性

表1所示為添加不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠抗菌率。從表1可看出：添加銀納米TiO2的濃度不同，其抗菌率也不同，在硅橡膠添加質(zhì)量分數(shù)為 2.0%或2.5% TiO2時，試樣對金黃色葡萄球菌的抗菌率為100%。圖2所示為不同濃度載銀納米TiO2硅橡膠試樣與菌液復合培養(yǎng)8 h后，取 20 μL菌液接種于血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的菌落生長狀況?？梢姡汉琓iO22.0%和2.5%的試樣均未見細菌生長。上述結果表明：當硅橡膠添加載銀納米TiO2含量為0～2.0%時，其抗菌率隨添加量增加而增加；當 TiO2添加量為 2.0%及以上時，其抗菌率達100%。

表1 添加載銀納米TiO2硅橡膠的抗菌率Table 1 Antibacterial ratio of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber

2.2 MTT結果

培養(yǎng)3 d后L929細胞形貌如圖3所示?？梢姡涸跐舛葹?00%，50%和10%的材料浸提液作用下，L929形態(tài)與陰性對照組相比無明顯差別，而陽性對照組細胞數(shù)量逐漸減少，細胞體積變小，最后無完整細胞，只能看到細胞裂解后的碎片。

根據(jù)MTT法測定的光密度OD計算相對增殖率(R)：

其中：ODt和ODc分別為實驗組和陰性對照組光密度。

根據(jù)相對增殖率進行細胞毒性分級(CTS)。添加載銀納米TiO2硅橡膠細胞毒性試驗結果如表2所示。可見：含2.0% TiO2的樣品浸提液與陽性對照組比較均差異顯著(P＜0.05)；不同濃度的浸提液間無顯著性差異，CTS均為0和1級，說明本研究添加載銀納米TiO2硅橡膠對 L929無毒性，符合《醫(yī)療器械生物學評價國家標準 GB/T 16886.5—2003》中對材料細胞毒性要求。

表2 添加載銀納米TiO2硅橡膠細胞毒性試驗結果Table 2 Results of cytotoxicity assay of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber

圖2 菌液與樣品培養(yǎng)8 h后再接種于血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d的菌落生長情況Fig.2 Colony growth situations of bacteria liquid cultured with samples for 8 h and then implanted blood agar cultured for 4 d

圖3 L929與添加載銀納米TiO2硅橡膠浸提液培養(yǎng)3 d后細胞形貌Fig.3 Situations of L929 cells cultured with leaching liquor of addition of Ag-embedded nano-TiO2 silicone rubber for 3 d

圖4 硅橡膠與L929細胞培養(yǎng)48 h后表面形貌Fig.4 SEM images of L929 cells after cultured 48 h with silicon rubber

2.3 添加載銀納米TiO2硅橡膠對L929黏附的影響

不含 TiO2和含 2.0% TiO2的硅橡膠樣品與 L929接觸培養(yǎng)48 h后，采用掃描電子顯微鏡檢測，結果如圖4所示?？梢姡翰缓琓iO2的樣品表面細胞伸展欠佳，部分細胞蜷縮變形成棗核狀(圖4(a))；在含2.0% TiO2的硅橡膠樣品表面細胞黏附于材料表面，大部分細胞呈長梭形，伸展良好，可見偽足，排列交織成網(wǎng)狀(圖4(b))。

3 討論

硅橡膠材料生物相容性好，是常用的假體植入材料，是上頜骨切除術后早期修復的首選材料，但硅橡膠表面細菌和真菌易附著，口腔感染機會增加，不利于傷口的愈合。有學者提出在硅橡膠中添加抗真菌藥及表面處理來改善硅橡膠的抗菌性能，如：Mark等[5]將克霉唑和置霉菌素加入硅橡膠中，發(fā)現(xiàn)有抗菌效果；Osterhof等[6]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：采用硅橡膠表面涂覆季銨硅烷涂層的方法能提高材料表面的抑菌性能，但作用效果短暫，不宜臨床推廣應用。納米無機抗菌劑是利用納米技術將無機抗菌劑制備成納米微?？咕鷦哂袠O大的比表面積，提高了與細菌的親和力[7-10]，具有高安全性、長效性、無耐藥性、廣譜性等優(yōu)點。本研究所采用的載銀納米 TiO2綜合了銀離子與納米 TiO2抗菌性能的優(yōu)點：實現(xiàn)銀的緩釋，延長殺菌功效，安全、持久、無耐藥性，能與高分子材料進行均勻混合。其抗菌機制可能是：銀沉積到納米TiO2表面，一方面，有效防止TiO2光催化時電子－空穴對的復合，從而促進了TiO2的光催化活性[11]；另一方面，銀離子既可與菌體中酶蛋白中的巰基結合，代謝關鍵酶失活，致使細菌不能代謝而死亡[12]，銀離子也可與致病菌 DNA堿基結合并形成交叉鏈接，置換嘌呤和嘧啶中相鄰氮之間的氫鍵，使 DNA變性而不能復制，導致致病菌失活[13]。

本研究采用浸漬培養(yǎng)法檢測添加載銀納米 TiO2硅橡膠的抗菌性能，檢測發(fā)現(xiàn)：隨著載銀納米 TiO2加入量的增加，抗菌率也增加，當TiO2加入量為2.0%和2.5%時，抗菌率可達100%?？赏茢嗫咕逝c添加載銀納米TiO2量有關，特別是與硅橡膠表面暴露的載銀納米 TiO2的量有關；當 TiO2添加量較低時，硅橡膠表面暴露的載銀納米TiO2的含量有限，故抗菌率較低；隨著添加量的增加，硅橡膠表面暴露的載銀納米TiO2的含量隨之增加，抗菌率也增高；當添加載銀納米 TiO2的含量為 2.0%時，硅橡膠材料已有很好的抗菌效果。結果說明：添加載銀納米TiO2抗菌劑的硅橡膠對L929無毒性，在硅橡膠中添加載銀納米TiO2的含量為2.0%比較合適。

影響細胞黏附的因素主要有表面形貌和粗糙度、表面化學、表面親水性、表面能和表面電荷等，一般認為：粗糙的表面結構、良好的表面化學組成、表面親水性、合適的表面自由能和表面電荷有利于細胞的黏附[14]。本研究在硅橡膠中添加載銀納米TiO2，體外細胞共培養(yǎng)，掃描電鏡檢測結果表明：添加載銀納米TiO2的硅橡膠有利于細胞的黏附。這可能與添加載銀納米 TiO2的硅橡膠表面暴露的納米粒子特有的表面界面效應有關，納米粒子的表面原子數(shù)量大于普通粒子表面原子的原子數(shù)量，由于缺少鄰近的配位原子而具備很高表面能，材料表面有許多不飽和化學鍵，提供了很多吸附位點與作用位點，極易與外來原子通過化學鍵結合，提高了與細胞的親和力，有利于細胞的黏附[15]。添加載銀納米TiO2的硅橡膠有望成為上頜骨切除術后早期修復的材料。

4 結論

(1) 添加載銀納米 TiO2的醫(yī)用硅橡膠具有抗菌性，當添加載銀納米TiO2含量為 0～2.0%時，其抗菌率隨添加含量增加而增加，當添加量為 2.0%及以上時，其抗菌率達100%。

(2) 添加載銀納米TiO2硅橡膠的浸提液無細胞毒性，符合生物材料細胞毒性要求。

(3) 在添加載銀納米TiO2硅橡膠的樣品表面黏附的細胞伸展良好，排列交織成網(wǎng)狀，而未添加載銀納米TiO2硅橡膠的樣品表面黏附的細胞伸展欠佳，偽足少，部分細胞蜷縮變形成棗核狀。添加載銀納米TiO2的硅橡膠有利于細胞的黏附。

[1] Rogers S N, Lowe D, McNally D, et al. Health-related quality of life after maxillectomy: A comparison between prosthetic obturation and free flap[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2003, 61(2):174-181.

[2] Erlich M A, Parhiscar A. Nasal dorsal augmentation with silicone implants[J]. Facial Plast Surg, 2003, 19(3): 325-330.

[3] Masella R P, Dolan C T, Laney W P. The prevention of the growth of Candida on Silastic 390 soft liner for dentures[J]. J Prosthet Dent, 1975, 33(3): 250-257.

[4] Keleher J, Bashant J. Photo-catalytic preparation of silver-coated TiO2particles for antibacterial applications[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2002, 18(2): 133-139.

[5] Mark A P, Millicent C G, James C L. The efficacy of antifungal agents incorporated into a facial prosthetic silicone elastomer[J].J Prosthet Dent, 1994, 71(3): 295-300.

[6] Osterhof J, Buijssen K, Busscher H, et al. Effect of quaternary ammonium silane coatings on mixed fungal and bacterial biofilms on tracheoesophage-Al shut prostheses[J]. Applied and Environmental microbiology, 2006, 72(5): 3673-3677.

[7] Wei J, Mashayekhi H, Xing B S. Bacterial toxicity comparison between nano- and microscaled oxide particles[J].Environmental Pollution, 2009, 157(5): 1619-1625.

[8] Jia H, Hou W, Wei L, et al. The structures and antibacterial properties of nano-SiO2supported silver/zinc-silver aterials[J].Dent Mater, 2008, 24(2): 244-249.

[9] Kawahara T, Ozawa T, Iwasaki M, et al. Photocatalytic activity of rutile-anatase coupled TiO2particles prepared by a dissolution-reprecipitation method[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2003, 267(2): 377-381.

[10] 陶振華, 趙華, 張海麗, 等. 納米二氧化鈦載銀無機抗菌劑的研究進展[J]. 化工中間體, 2007(4): 22-25.TAO Zhen-hua, ZHAO Hua, ZHANG Hai-li, et al. Progress in the antibacterial agent of silver-loaded nano-TiO2[J]. Chemical Intermediate, 2007(4): 22-25.

[11] Lee H J, Yeo S Y, Jeong S H. Antibacterial effect of nanosized silver colloidal solution on textile fabrics[J]. Journal of Materials Science, 2003, 38(10): 2199-2204.

[12] Liau S Y, Read D C, Pugh W J, et al. Interaction of silver nitrate with readily identifiable groups relationship to the antibacterial action of silver ions[J]. Lett Appl Microbiol, 1997, 25(4):279-282.

[13] Feng Q L, Wu J, Chen G Q, et al. A mechanistic study of the antibacterial effect of silverions on Escherichla coll and Staphylococcus aures[J]. Biomed Mater Res, 2000, 52(4):662-668.

[14] Khorasani M T, Moemen B S, Mirzadeh H, et al. Effect of surface charge and hydrophobicity of polyurethanes and silicone rubbers on L929 cells response[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2006, 51(2): 112-119.

[15] Hong S I, Rhim J W. Antimicrobial activity of organically modified nano-clays[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2008, 8(11):5818-5824.