洋鐵酸模提取物體外抑真菌作用活性部位篩選研究

孫全樂,蔡廣知,殷 丹,沈曉君,貢濟宇

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林長春130117)

中藥洋鐵酸模作為一種古老的中草藥,在民間應(yīng)用已有上千年的歷史,臨床應(yīng)用該藥治療皮膚疾患和止血,療效確切。洋鐵酸模在我省廣泛分布,資源豐富。開發(fā)潛力巨大,應(yīng)用前景廣闊。因此,本試驗對洋鐵酸模的抑菌活性進行研究,以白色念珠菌、紅毛癬菌為例,旨在為其藥用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持,以期充分開發(fā)利用我省的該種藥用資源。

1 材料與儀器

1.1 材料 實驗用洋鐵酸模藥材均于2007年采于吉林省,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室張雅芝教授鑒定為洋鐵酸模(Rumex patlent L.var.eallosus F.Sehm.etMaxim)。兩種真菌即紅毛癬菌(Trichophyton rubrum)20株、白色念珠菌(Candida allbicans)16株,均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室真菌菌種保藏中心提供。實驗前均經(jīng)活化接種。

1.2 儀器與設(shè)備 C52型醫(yī)用超凈工作臺、DHG-9132A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱;YXQ.SG41.80型高壓蒸汽滅菌鍋、HH.SI1-2型電熱恒溫水浴鍋、R51型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

2 實驗方法

2.1 供試菌的準(zhǔn)備 將白色念珠菌、紅毛癬菌分別接入斜面培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)72 h。再移種至沙氏培養(yǎng)基中,在28℃培養(yǎng)24 h,取出備用。

2.2 平板的制備 配制好培養(yǎng)基,沙氏培養(yǎng)基(蛋白胨10 g,葡萄糖40g,瓊脂15 g,加入無菌水1000 mL,攪拌加熱煮沸至完全溶解)經(jīng)高壓蒸汽消毒滅菌后,冷卻至50℃左右,無菌操作下倒入干熱滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi),每皿約15～20 mL,即培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度約2～2.5 mm,準(zhǔn)備夠充足數(shù)量。

2.3 樣品溶液的制備 洋鐵酸模藥材分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取、水提取,精密稱取 4種提取物分別將各部位以DMF(N,N二甲基甲酰胺)為溶劑均配制成10 g生藥/mL,分別于115℃,高壓滅菌30 min備用。

2.4 供試菌菌懸液的制備 將測試菌于25℃環(huán)境下活化,用接種環(huán)挑取少許菌加入生理鹽水充分振蕩,制備菌懸液,采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌懸液濃度達0.5 Mcfarland單位,即含1.5×107～108cfu/mL,稀釋10倍,備用。

2.5 抑菌濾紙片的制備 使用內(nèi)徑為6 mm的打孔器在定性濾紙上均勻打孔,將濾紙片裝入50 mL的三角錐形瓶中,塞上棉塞,121℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。在醫(yī)用型超凈工作臺中,分別將相應(yīng)數(shù)量的無菌濾紙片浸泡在裝有供試液相應(yīng)錐形瓶中,浸泡3 h后作為抑菌濾紙片備用。

2.6 抑菌試驗 在無菌條件下用微量移液器吸取菌懸液100 μ L,滴在平板培養(yǎng)基上,用涂布器涂勻。分別將4種提取物抑菌濾紙片以三點法放在涂有菌液的培養(yǎng)基上,重復(fù)做3次,做好標(biāo)記;另外同時將4種提取物放于同一培養(yǎng)皿中,重復(fù)做3次,做好標(biāo)記,將抑菌平皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中。另設(shè)對照組,對照組分別加入DMF,28℃培養(yǎng)72 h后,取出測定抑菌圈直徑大小,根據(jù)抑菌圈大小計算出抑菌率[1-2]。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理[2],各組總體均數(shù)用單因素方差分析比較(ANOVA),分別比較洋鐵酸模的4種提取物于同一皿中的抑菌效果,采用 t檢驗。

2.8 最小抑菌濃度的確定 采用連續(xù)稀釋法[3-4]。在滅菌的培養(yǎng)管中加入2 mL經(jīng)滅菌的液體沙氏培養(yǎng)基,用微量移液器吸取洋鐵酸模提取物原液,使洋鐵酸模提取物濃度倍比稀釋為120,60,30,15,7.5 mg/mL系列濃度,各加入20 μ L 菌懸液,于28℃培養(yǎng)72 h后,以未接種的培養(yǎng)液加空白溶劑為對照,測定乙酸乙酯提取物對36株臨床常見皮膚癬菌的最小抑菌濃度(MIC)值。

2.9 溫度對提取物抑菌活性的影響 洋鐵酸模乙酸乙酯提取物分別經(jīng)40,60,80℃處理2 h后,檢測其抑菌活性。

3 結(jié)果與分析

3.1 洋鐵酸模提取物對真菌的抑菌效果 見表1,表2。

表1 洋鐵酸模提取物對真菌紅毛癬菌抑菌效果 mm

表2 洋鐵酸模提取物對真菌白色念珠菌抑菌效果 mm

3.2 洋鐵酸模提取物對真菌的抑菌率 見表3。

表3 洋鐵酸模提取物對真菌的抑菌率

3.3 溫度對乙醇乙酯提取物抑菌活性的影響 見表4。

表4 溫度對乙酸乙酯提取物抑菌活性的影響

3.4 最小抑菌濃度 見表5。

表5 乙酸乙酯提取物對真菌的最小抑菌濃度

4 討論

4.1 洋鐵酸模的4種粗提液與對照組比較,洋鐵酸模石油醚提取物、洋鐵酸模乙酸乙酯提取物、洋鐵酸模正丁醇提取物、洋鐵酸模水提物的抑菌效果均強于對照組。

4.2 洋鐵酸模的4個部位比較,其中乙酸乙酯部位、對紅毛癬菌的生長均有一定的抑制作用,而正丁醇部位抑菌作用不理想,其他兩個部位無明顯作用。

4.3 洋鐵酸模2個部位對紅毛癬菌的生長有較明顯的抑制作用,而對白色念珠菌的抑制作用很弱。

4.4 洋鐵酸模乙酸乙酯提取物對紅毛癬菌的最小抑菌濃度為30 mg/mL;而對白色念珠菌的最小抑菌濃度為120 mg/mL。

4.5 該提取物的抑菌成分在40,60℃下(處理2 h)較穩(wěn)定,但在80℃以上溫度時,穩(wěn)定性較差。

本實驗研究結(jié)果驗證了洋鐵酸?？梢种普婢L,同時篩選出的活性部位為乙酸乙酯層。筆者認(rèn)為乙酸乙酯提取物的主要成分尚待進一步分離、鑒定。如能進一步分離具體的抑菌成分,有望開發(fā)洋鐵酸模相關(guān)抑菌產(chǎn)品[5-6]。

[1]鮑敏,米琴,曾陽.藏藥分布不同提取物的體外抑菌實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(8):1410-1411.

[2]Tsuboi R.Ogawa H,Bramono K,et al.Pathogenesis of superficial mycoses[J].J Med Verterin ycol,1994,32(suppl.l):91-104.

[3]張志仁,張大方,李麗靜,等.附子炮制前后有效部位對正常及心衰大鼠血流動力學(xué)影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,25(3):331-332.

[4]王丹,李春艷,史勇.中藥足浴臨床應(yīng)用小結(jié)[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,25(1):118.

[5]賁彥鴻,張秀波,陳聲武,等.盆炎清顆粒抑菌作用實驗研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,24(4):368.

[6]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference Method for BrothDilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi:Approurd Standard(M38-A)[M].Pennsylvania:CLSI,2002:119.