14-3-3β蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

薛孟華,高素君,田慧敏,吳 勇,劉 偉*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.胸外科;2.血液腫瘤科,吉林 長(zhǎng)春130021)

我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率連年攀升[1],特別是非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人民健康的惡性腫瘤。14-3-3蛋白作為一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的調(diào)節(jié)蛋白,通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白相互作用而參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及惡性轉(zhuǎn)化等各種細(xì)胞過(guò)程[2];現(xiàn)已研究證實(shí)14-3-3蛋白與多種惡性腫瘤包括肺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[3],但是14-3-3蛋白由于有多種亞型且不同亞型在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中的作用至今未明確[4-6];14-3-3蛋白的β亞型(14-3-3β蛋白)作為14-3-3蛋白家族中的一種重要亞型在NSCLC中的表達(dá)及其臨床意義目前尚未見(jiàn)詳盡報(bào)道。本研究利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)的方法來(lái)評(píng)價(jià)14-3-3β蛋白在NSCLC中的表達(dá)情況及其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組85例NSCLC石蠟組織切片取自1998年1月-2003年12月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療且隨訪(fǎng)資料完整的患者,所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí);其中男性63例,女性22例;年齡在35-77歲之間,中位年齡62歲;無(wú)吸煙史者29例,有吸煙史者56例;根據(jù) 1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期39例,Ⅱ期24例,Ⅲ期22例;病理類(lèi)型中鱗癌51例,腺癌 34例;隨訪(fǎng)截止日期為2008年4月8日,平均隨訪(fǎng)時(shí)間48±6個(gè)月。

1.2 組織芯片制備

復(fù)檢85例NSCLC石蠟組織HE染色切片,標(biāo)記供體蠟塊靶點(diǎn);利用組織芯片制作儀(Beecher Instruments公司),從供體蠟塊上穿取直徑為1 mm組織芯3條,依次插入有135個(gè)點(diǎn)陣的受體蠟塊中;在52℃恒溫烤箱中制作組織芯片蠟塊;以5 μ m厚度連續(xù)切片,陣列切片置于60℃恒溫烤箱中烤片16個(gè)小時(shí);組織芯片進(jìn)行HE染色復(fù)檢合格后置于5℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 試劑及方法 一抗采用兔抗人多克隆14-3-3β抗體(Santa Cruz公司),二抗采用DAKO二步法抗兔免疫組化檢測(cè)試劑盒(EnVision+/HRP/Rb),DAKO抗體稀釋液及顯色劑二氨基聯(lián)苯胺均購(gòu)自DAKO公司。

1.3.2 結(jié)果判定 14-3-3β蛋白陽(yáng)性染色信號(hào)位于胞漿,胞漿染色或胞漿、胞膜同時(shí)染色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞;胞漿染色強(qiáng)度分 0-3級(jí),0:陰性,1:弱陽(yáng)性,2:中陽(yáng)性,3:強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3.3 免疫組化染色評(píng)價(jià) 高倍鏡下計(jì)算14-3-3β蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性染色強(qiáng)度,每百個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度乘積作為免疫組化染色評(píng)分,分值≥200者為陽(yáng)性表達(dá),＜200者即為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 χ2檢驗(yàn)分析14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理類(lèi)型及腫瘤分期等臨床病理因素的關(guān)系,P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;單因素生存分析采用Kaplan-Meier法、經(jīng)Log-rank差異性檢驗(yàn)并繪制生存曲線(xiàn),統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS13.0。

2 結(jié)果

85例NSCLC患者中14-3-3β蛋白表達(dá)陽(yáng)性者40例(47%),陰性者45例(53%),14-3-3β蛋白在不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類(lèi)型、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)及腫瘤分期以及不同病理類(lèi)型(鱗癌和腺癌)中的表達(dá)情況如表1所示。統(tǒng)計(jì)表明14-3-3β蛋白在鱗癌中的表達(dá)顯著高于腺癌(57%vs 32%,P＜0.05,14-3-3β蛋白在NSCLC中鱗癌和腺癌的陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)如圖1所示)。14-3-3β蛋白的表達(dá)與年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤大小、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期無(wú)關(guān)。預(yù)后生存分析顯示14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)組中位生存期56個(gè)月,陰性表達(dá)組中位生存期42個(gè)月,14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后優(yōu)于陰性表達(dá)者,兩組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(生存率曲線(xiàn)如圖2所示)。

表1 14-3-3β蛋白的表達(dá)與NSCLC不同臨床病理因素的關(guān)系

圖1 14-3-3β蛋白在NSCLC鱗癌與腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)。(A:14-3-3β蛋白在鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá);B:14-3-3β蛋白在腺癌中的陽(yáng)性表達(dá);C:14-3-3β蛋白在鱗癌中的陰性表達(dá);D:14-3-3β蛋白在腺癌中的陰性表達(dá);左圖 ×40,右圖×400。)

圖2 14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者和陰性表達(dá)患者生存率曲線(xiàn)(P=0.024)

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 14-3-3 蛋白家族具有β 、γ、ε、η、σ、θ和ζ等七種不同亞型,各種亞型通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)上百種靶蛋白相互作用,參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞黏附運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等細(xì)胞進(jìn)程;本研究結(jié)果證明14-3-3β蛋白在NSCLC中存在較高表達(dá),總陽(yáng)性表達(dá)率為47.1%。14-3-3蛋白家族各個(gè)亞型功能是通過(guò)調(diào)節(jié)靶蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn),而這些靶蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能起著腫瘤抑制基因或原癌基因等截然不同作用[7,8],所以這一蛋白家族不同亞型有不同的促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展作用。14-3-3β蛋白在NSCLC中作用機(jī)制尚不清楚,現(xiàn)有研究表明可能的機(jī)制有:(一)MAPK(Mito-Activated Protein Kinase)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活需要14-3-3β蛋白參與,而且MAPK活性增強(qiáng)與14-3-3β蛋白過(guò)度表達(dá)呈正相關(guān),14-3-3β蛋白還可以通過(guò)與Raf-1相互作用來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)MAPK信號(hào)通路激活,所以14-3-3β蛋白可通過(guò)促進(jìn)MAPK活性增強(qiáng)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化;(二)14-3-3β蛋白與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白如PKC(Protein Kinase C)、PI3K(Phosphatidyl-3-Kinase)、磷酸化 Bad以及CDC25(Cell Division Cyclin 25)交互作用,參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程[9]。由此可見(jiàn),14-3-3β蛋白在肺癌發(fā)生中主要起著原癌基因作用。

14-3-3蛋白家族另一重要特點(diǎn)是不同亞型對(duì)不同組織有不同親和性。如Qi等人發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白家族中β、γ、σ和θ亞型在肺鱗癌和腺癌中存在高表達(dá),而ε和ζ亞型僅在正常肺組織中存在表達(dá)[10];目前關(guān)于NSCLC中14-3-3β蛋白在鱗癌和腺癌中的表達(dá)是否存在差異尚未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道,本研究結(jié)果表明14-3-3β蛋白在鱗癌中陽(yáng)性表達(dá)率為56.9%,而在腺癌中為32.4%,二者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),可見(jiàn)14-3-3β蛋白可能與鱗癌發(fā)生有更密切關(guān)系。盡管本研究并未發(fā)現(xiàn)14-3-3β蛋白的表達(dá)在吸煙患者中與非吸煙患者中有明顯差異,但是由于肺鱗癌與吸煙有密切關(guān)系,而且有研究報(bào)道煙草中尼古丁可以通過(guò)激活ERK1/2(Extracellular signal-Regulated Kinase)、AKT、PKA(Protein Kinase A)來(lái)誘導(dǎo) Bad多個(gè)位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致Bad與線(xiàn)粒體分離而與14-3-3β蛋白結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[11],這可能是肺鱗癌中14-3-3β蛋白高表達(dá)的機(jī)制之一。

本研究未發(fā)現(xiàn) 14-3-3β蛋白表達(dá)與NSCLC性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀況及腫瘤分期等因素有關(guān),但是通過(guò)單因素生存分析發(fā)現(xiàn)14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后要好于陰性表達(dá)者,二者具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)14-3-3β蛋白與肺癌預(yù)后有關(guān),但是有研究證實(shí)14-3-3β蛋白可以與Wee1直接結(jié)合,延長(zhǎng)Wee1的半衰期從而提高細(xì)胞內(nèi)Wee1蛋白的表達(dá)水平,增強(qiáng)Wee1激酶活性導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2-M期,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12],這可能是14-3-3β蛋白陽(yáng)性的NSCLC患者預(yù)后較好的原因之一。當(dāng)然,NSCLC的預(yù)后是由多種因素共同作用的結(jié)果,不能通過(guò)14-3-3β蛋白這一單一機(jī)制解釋。

14-3-3β蛋白作為調(diào)節(jié)蛋白,通過(guò)與多個(gè)靶蛋白結(jié)合可以把細(xì)胞內(nèi)單一的信號(hào)傳導(dǎo)變成眾多的網(wǎng)絡(luò)化信號(hào)傳導(dǎo),而且在不同細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間、在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段可能會(huì)扮演不同角色。正如前所述,14-3-3β蛋白在非小細(xì)胞肺癌中可能存在著多種作用,如14-3-3β蛋白可能與某些靶蛋白(如MAPK、Bad)結(jié)合起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用,也可能在某些情況下與另外靶蛋白(如Wee1)結(jié)合,起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤的作用。

綜上,本研究通過(guò)組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)了14-3-3β蛋白在NSCLC中的表達(dá),并證明14-3-3β蛋白在鱗癌中表達(dá)高于腺癌,且14-3-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后好于陰性表達(dá)者;隨著對(duì)14-3-3β蛋白研究的進(jìn)一步深入,期待著將來(lái)14-3-3β蛋白可以作為NSCLC早期診斷、靶向治療、預(yù)判斷后、療效監(jiān)測(cè)等方面的重要生物標(biāo)記物。

[1]Yang L,Parkin DM,Ferlay J,et al.Estimates of cancerincidence in China for 2000 and projections for 2005[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14:243.

[2]van Hemert MJ,Steensma HY,van Heusden GP.14-3-3 proteins:key regulators of cell division,signaling and apoptosis[J].Bioessays,2001,23:936.

[3]Nakanishi K,Hashizume S,Kato M,et al.Elevated expression levels of the 14-3-3 family of proteins in lung cancer tissues[J].Hum Antibodies,1997,8:189.

[4]Li DJ,Deng G,Xiao ZQ,et al.Identificating 14-3-3 sigma as a lymph node metastasis-related protein in human lung squamous carcinoma[J].Cancer Lett,2009,279(1):65.

[5]Osada H,Tatematsu Y,Yatabe Y,et al.Frequent and histological typespecific inactivation of 14-3-3sigma in human lung cancers[J].Oncogene,2002,21(15):2418.

[6]Nakajima T,Shimooka H,Weixa P,et al.Immunohistochemical demonstration of 14-3-3 sigma protein in normal human tissues and lung cancers,and the preponderance of its strong expression in epithelial cells of squamous cell lineage[J].Pathol Int,2003,53(6):353.

[7]Yip-Schneider MT,Miao W,Lin A,et al.Regulation of the Raf-1 kinase domain by phosphorylation and 14-3-3 association[J].Biochem J,2000,351(Pt 1):151.

[8]Seimiya H,Sawada H,Muramatsu Y,et al.Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase[J].EMBO J,2000,19(11):2652.

[9]Takihara Y,Matsuda Y,Hara J.Role of the beta isoform of 14-3-3 proteins in cellular proliferation and oncogenic transformation[J].Carcinogenesis,2000,21(11):2073.

[10]Qi W,Liu X,Qiao D,et al Isofor m-specific expression of 14-3-3 proteins in human lung cancer tissues[J].Int J Cancer,2005,113(3):359.

[11]Jin Z,Gao F,Flagg T,et al.Nicotine induces multi-site phosphorylation of Bad in association with suppression of apoptosis[J].J Biol Chem,2004,279(22):23837.

[12]Wang Y,JacobsC,HookKE,et al.Binding of 14-3-3beta to the carboxyl terminus of Wee1 increases Wee1 stability,kinase activity,and G2-M cell population[J].Cell Growth Differ,2000,11(4):211.