藏靈菇發(fā)酵乳中乳酸菌的分離純化與鑒定

黃 穎,杜 娜,張,鄭永晨*

藏靈菇是一種乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物(由微生物產(chǎn)生的胞外多糖與乳蛋白聚合而成),外形酷似米粒,上面棲息著多種微生物,經(jīng)過長(zhǎng)期在牛奶中培養(yǎng),個(gè)體會(huì)增大很多,形狀如盛開的雪蓮,所以有人稱之為“西藏雪蓮”[1]。藏靈菇是一種天然的乳品發(fā)酵劑,有良好的發(fā)酵特性,用它制作的酸奶與傳統(tǒng)的酸奶或用其它純種乳酸菌發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品有很大的不同,最顯著的特征是除乳酸發(fā)酵外,還伴有輕微的由酵母菌引起的酒精發(fā)酵,是一種集酸、乙醇味于一體的新型發(fā)酵乳制品,將其作為乳品家族的一個(gè)新品加以開發(fā),具有很好的市場(chǎng)前景。目前這種產(chǎn)品都是以藏靈菇為發(fā)酵劑進(jìn)行制作,由于藏靈菇上微生物的組成比較復(fù)雜,用發(fā)酵劑傳代的方法進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn),極易發(fā)生菌相失衡,使發(fā)酵乳的風(fēng)味和品質(zhì)發(fā)生變化,失去原有的優(yōu)良特征,限制了它的工業(yè)化生產(chǎn)[2]。本研究對(duì)藏靈菇發(fā)酵乳中益生菌進(jìn)行了分離和鑒定,以期為藏靈菇發(fā)酵工業(yè)中的發(fā)酵劑純培養(yǎng)研究和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 藏靈菇由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物教研室提供。培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基,光明乳業(yè)無抗生素純牛奶。

1.2 方法

1.2.1 藏靈菇發(fā)酵乳的制備 藏靈菇用無菌水沖洗后,按2%(W/V)的比例接種到純牛奶中,30℃培養(yǎng)24 h,過濾出藏靈菇,再次加入到純牛奶中培養(yǎng)24 h。如此連續(xù)活化3次,最后一次發(fā)酵乳濾液留備試驗(yàn)用。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化 藏靈菇發(fā)酵乳濾液1 ml,用無菌生理鹽水以10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7倍的稀釋菌懸液。分別從上述2種菌懸液中選擇3個(gè)最高稀釋度,每個(gè)稀釋度取0.1 ml,分別涂布于MRS平板,37℃培養(yǎng)48-72 h,然后挑取不同形態(tài)的典型菌落制片,革蘭氏染色觀察并進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)。凡屬革蘭氏陽性菌兼接觸酶陰性的菌落繼續(xù)在原培養(yǎng)基上劃線純化,重復(fù) 2-3次,直至鏡檢為純培養(yǎng)物止。純化后的菌株接種至MRS斜面上培養(yǎng),培養(yǎng)后至4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳酸菌的生理生化鑒定 包括明膠液化試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)黏液試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)等[3]。

1.2.4 細(xì)菌 DNA的提取及16S rRNA的PCR擴(kuò)增[4]細(xì)菌DNA的提取采用酚-氯仿法,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)菌DNA。以提取到的細(xì)菌DNA為模板,利用 Taq酶及 16S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95℃5 min;94℃30 s,50℃30 s,72℃1 min,30個(gè)循環(huán);72℃15 min;10℃5 min;4℃保存。

1.2.5 16S rRNA序列測(cè)定與分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工公司測(cè)序,序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),搜索與測(cè)序結(jié)果相近序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 菌株的生物學(xué)特性

①生長(zhǎng)特性 將分離到的菌種按 3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng),每 2 h測(cè)定一次發(fā)酵液 OD600和pH。

②耐酸性試驗(yàn) 將活化3代的分離到的菌種懸液按3%的接種量分別接入pH 2.0和 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng),分別于0 、30、60、90、120 min進(jìn)行MRS平板菌落計(jì)數(shù)。

③耐膽鹽試驗(yàn) 將活化3代分離到的的菌種懸液按3%的接種量分別接入含0.3%和0.5%膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng),分別于0、2、4 h進(jìn)行MRS平板菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 藏靈菇發(fā)酵乳中乳酸菌屬種的鑒定

本研究從藏靈菇發(fā)酵乳中分離到2株乳酸菌,其形態(tài)及部分生理學(xué)特性見表1。該2株菌均不運(yùn)動(dòng),均在10℃下生長(zhǎng),45℃不生長(zhǎng),硝酸鹽還原、明膠液化、產(chǎn)硫化氫及淀粉水解試驗(yàn)皆為陰性,結(jié)合糖發(fā)酵試驗(yàn)與16S rRNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果,初步確定:LP1為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum);LA1為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。

2.2 菌株的生物學(xué)特性

2.2.1 生長(zhǎng)特性

LP1和LA1的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知,LA1前8h生長(zhǎng)緩慢,10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,18 h后生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期。LP1前10 h生長(zhǎng)緩慢,12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,20 h后生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期。LA1產(chǎn)酸速度開始較快,8 h后pH就降至5以下,產(chǎn)酸平穩(wěn),pH基本維持在4.0左右。LP1產(chǎn)酸速度較慢,10 h后pH才降至5以下,產(chǎn)酸平穩(wěn),pH基本維持在4.2左右。

表1 藏靈菇發(fā)酵乳中乳酸菌鑒定結(jié)果

圖1 LA1的生長(zhǎng)曲線和pH值變化

圖2 LP1的生長(zhǎng)曲線和pH值變化

2.2.2 耐酸性實(shí)驗(yàn)

在120 min的培養(yǎng)過程中,pH 2時(shí),LP1和LA1的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制,30 min后LP1的活菌數(shù)開始明顯下降,90 min后LA1的活菌數(shù)也迅速下降,120 min時(shí),LA1的活菌數(shù)尚能維持在104cfu/ml水平,LP1僅達(dá)102cfu/ml,可見LA1的耐酸能力較LP1強(qiáng)。pH 3和4時(shí),兩株菌的活菌數(shù)在120 min雖都有所下降,仍可維持一個(gè)較高水平。

表2 菌株的酸耐受性能(活菌數(shù)log cfu/ml)

2.2.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

在含膽鹽濃度(m/v)為0.3%的液體MRS中培養(yǎng)4 h后,與不含膽鹽的空白組相比,兩株菌活菌數(shù)略有下降,但仍保持在107cfu/ml,活菌數(shù)差異并不顯著。相對(duì)而言,0.5%牛膽鹽對(duì)菌株的抑制作用稍強(qiáng),在培養(yǎng)4 h后,LP1和LA1活菌數(shù)分別維持在104cfu/ml和106cfu/ml,LA1耐膽鹽能力較強(qiáng)。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)一些地區(qū)流行飲用藏靈菇浸泡奶,實(shí)質(zhì)上是利用藏靈菇作為發(fā)酵劑,發(fā)酵牛奶。藏靈菇中微生物較普通酸奶發(fā)酵劑復(fù)雜,除含乳酸菌外,還含有酵母菌。現(xiàn)在對(duì)藏靈菇的研究,僅僅是從藏靈菇中分離出部分菌株,對(duì)藏靈菇中微生物的種群結(jié)構(gòu)及發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物缺乏了解,因而對(duì)藏靈菇作為發(fā)酵劑的發(fā)酵機(jī)理及其發(fā)酵奶所具有的保健效果不能做出科學(xué)的解釋,使得藏靈菇在民間一直保持著神秘色彩。

表3 菌株的膽鹽耐受性能(活菌數(shù)log cfu/ml)

本研究從藏靈菇發(fā)酵乳中分離到兩株乳酸菌,對(duì)分離得到的兩株乳酸菌進(jìn)行了生理生化和16S rDNA序列同源性分析,并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定這兩株菌分別為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。

由于乳酸菌必須進(jìn)入人體的胃腸道才能發(fā)揮其功能,因此要求乳酸菌能耐受有機(jī)體的防御機(jī)制,其中包括胃液中的低pH和小腸中的高膽鹽等[5]。生物學(xué)特性結(jié)果顯示,LA1和LP1在pH 2.0和膽鹽濃度為0.3%、0.5%的MRS培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 h和4 h后,活菌數(shù)基本上仍可達(dá)到104cfu/ml,以上,表明具有較好的耐酸和耐膽鹽能力。

藏靈菇是個(gè)復(fù)雜的微生物共生體系,其中應(yīng)該還包括一些因試驗(yàn)條件所限而未分離出來的菌株,有待進(jìn)一步深入研究。

[1]劉變芳,孔慶學(xué),郭藹光.自然發(fā)酵劑“西藏雪蓮”的初步研究與菌種鑒定[J].中國(guó)釀造,2004,11(11):11

[2]周劍忠,董明盛,江漢湖.PCR-DGGE指紋技術(shù)與分離技術(shù)結(jié)合篩選藏靈菇發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(8):1632.

[3]東秀珠,蔡妙營(yíng).常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[4]Giraffa G,Rossetti L,Neviani E.An evaluation of chelex-based DNA purification protocols for the typing of lactic acid bacteria[J].Journal of MicrobiologicalMethods,2000,42:175.

[5]辛 羚,郭本恒,吳正鈞.3株乳桿菌在模擬消化環(huán)境中存活性能的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2005,33:15.