時間和劑量的選擇:預(yù)防使用甲基強的松龍對脊髓損傷后大鼠氧自由基的影響

楊建東,王靜成,費文勇,蔣百川,馮新民,蔡 俊

(揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院骨科,江蘇揚州,225001)

脊髓損傷分原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。由于原發(fā)性脊髓損傷的不可逆性,目前對原發(fā)性脊髓損傷還無法進行有效治療。目前對脊髓損傷后的藥物治療主要是針對繼發(fā)性脊髓損傷。在繼發(fā)性脊髓損傷中,氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化起著很重要的作用。研究表明,大劑量甲基強的松龍(MP)可抑制脂質(zhì)過氧化,預(yù)防應(yīng)用大劑量甲基強的松龍對急性脊髓損傷(ASCI)有一定的神經(jīng)保護功能[1-4],但預(yù)防使用的時間和劑量則鮮見文獻報道。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上[2-4],對預(yù)防應(yīng)用大劑量甲基強的松龍的時間和劑量進行了初步研究,以期指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康成年SD大鼠60只,雌雄不限,體質(zhì)量(250±20)g,揚州大學(xué)實驗動物中心提供。其中54只采用3×3析因設(shè)計進行分組,隨機分為9組,每組6只。甲基強的松龍的使用劑量分別為15、30、60 mg/kg;使用時間分別在脊髓打擊前的15、30、60 min。另設(shè)一脊髓損傷組(SCI組,6只)作為對照。甲基強的松龍琥珀酸鈉(法瑪西亞-普強公司產(chǎn)品,批號KD1519)。

1.2 動物模型制作

采用Allen′s重物打擊脊髓損傷模型。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉,按無菌原則在顯微鏡下暴露T8-9脊髓。在暴露的硬膜表面放置1個3 mm×2 mm的弧形墊片。將圓柱狀金屬棒沿細玻璃導(dǎo)管垂直、自由落下,制成脊髓損傷模型。重物重量10 g,高度5 cm。甲基強的松龍按前述時間、劑量由尾靜脈推注。然后關(guān)閉切口。在脊髓損傷后72 h取材,分別進行血清、脊髓損傷段超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的檢測。

1.3 超氧化物歧化酶、丙二醛的檢測

由大鼠心臟取血2 mL,低溫離心機3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min,取上清液置-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。取脊髓損傷段約1.5 cm,冰鹽水沖洗去血液,吸干液體,稱重,加冰雙蒸水,用組織勻漿器制成100 g/L組織勻漿液,低溫離心機3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min,取上清液置-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。按南京建成生物工程研究所SOD、MDA試劑盒說明書進行測定、計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SAS 6.12統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù),預(yù)防使用MP各組之間行SNK檢驗;預(yù)防使用MP各組與SCI組之間行Dunnett檢驗。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差(±s)表示。以α=0.05位檢驗水準進行雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 血清SOD值

脊髓損傷后72 h血清SOD值見表1所示,SCI組血清SOD值為(67.79±2.74)U/mL。

表1 脊髓損傷后72 h大鼠血清SOD值(U/mL)

通過3×3析因方差分析,MP使用劑量對血清SOD值有影響(P<0.01),MP使用時間對血清SOD值沒有影響,且MP使用劑量與使用時間之間無交互作用。

將預(yù)防性使用大劑量MP的各組與SCI組進行Dunnett檢驗 ,顯示 :30 mg/kg～3 0 min、30 mg/kg ～ 15 min、30 mg/kg～ 60 min 、60 mg/kg～30 min等組與SCI組有顯著差異。而MP各組之間進行SNK檢驗,顯示:30 mg/kg～30 min組血清SOD值明顯高于其余各組。

表明在血清SOD值上,預(yù)防性使用MP 30 mg/kg組效果明顯,其中,又以提前 30 min使用升高血清SOD值最明顯。

2.2 損傷段脊髓SOD值

脊髓損傷后72 h損傷段脊髓SOD值見表2所示 ,SCI組損傷段脊髓SOD值為(24.99±2.96)U/mg,見表 2。

表2 脊髓損傷后72 h大鼠損傷段脊髓SOD值(U/mg)

通過3×3析因方差分析,MP使用劑量對損傷段脊髓SOD值有影響(P<0.01);MP使用時間對損傷段脊髓SOD值沒有影響,且MP使用劑量和使用時間之間無交互作用。

MP各組與SCI組進行Dunnett檢驗,顯示:30 mg/kg ～ 30 min、30 mg/kg～ 15 min 、30 mg/kg～60 min、60 mg/kg～30 min、60 mg/kg～60 min等組與SCI組有顯著差異。而MP各組之間進行SNK檢驗,顯示:30 mg/kg～30 min組損傷段脊髓SOD值明顯高于其余各組。

表明在損傷段脊髓SOD值上,預(yù)防性使用MP 3 0mg/kg、60 mg/kg組均有效果(除外60 mg/kg～15 min),但以提前30 min使用者升高損傷段脊髓SOD值最明顯。

2.3 血清MDA值

脊髓損傷后72 h血清MDA值見表3所示,SCI組血清MDA值為(14.57±1.19)nmol/mL。

表3 脊髓損傷后72 h大鼠血清MDA值(nmol/mL)

通過3×3析因方差分析,MP使用劑量對血清MDA值有影響(P<0.01),MP使用時間對血清MDA值沒有影響,且MP使用劑量和使用時間之間無交互作用。

MP各組與SCI組進行Dunnett檢驗,顯示:30 mg/kg～ 30 min、30 mg/kg～ 15 min 、30 mg/kg～ 60min、60mg/kg～ 30min、60mg/kg～ 15min、60 mg/kg～60 min等組與SCI組有顯著差異。而MP各組之間進行SNK檢驗,顯示:30 mg/kg～30 min組血清MDA值明顯小于其余各組。

表明在血清MDA值上,預(yù)防性使用MP 30 mg/kg、60 mg/kg組效果明顯,其中,又以提前30 min使用降低血清MDA值最明顯。

2.4 損傷段脊髓MDA值

脊髓損傷后72 h損傷段脊髓MDA值見表4所示,SCI組損傷段脊髓MDA值為(8.48±1.26)nmol/mg。

表4 脊髓損傷后72 h大鼠損傷段脊髓MDA值(nmol/mg)

通過3×3析因方差分析,MP使用劑量對損傷段脊髓MDA值有影響(P<0.01),MP使用時間對損傷段脊髓MDA值沒有影響,且MP使用劑量和使用時間之間無交互作用。

MP各組與SCI組進行Dunnett檢驗,顯示:30 mg/kg～ 30 min、30 mg/kg～ 15 min 、30 mg/kg～ 60min、60mg/kg～ 30min、60mg/kg～ 60min、60 mg/kg～15 min等組與SCI組有顯著差異。而MP各組之間進行SNK檢驗,顯示:30 mg/kg～30 min組損傷段脊髓MDA值明顯小于其他組。

說明在損傷段脊髓MDA值上,預(yù)防性使用MP 30 mg/kg、60 mg/kg組效果明顯,其中,又以提前30 min使用降低損傷段脊髓MDA值最明顯。

3 討 論

隨著對脊髓損傷研究的不斷深入,各國學(xué)者提出了多種脊髓繼發(fā)性損傷病理生理機制的學(xué)說。其中,最重要的是脂質(zhì)過氧化和自由基學(xué)說。生理狀態(tài)下,人體為維持各種細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的完整性,雖然產(chǎn)生一定的自由基(FR),但內(nèi)源性氧化系統(tǒng)如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶可以有效地消除自由基。SCI后,機體可通過多種環(huán)節(jié)使FR增高,這些氧自由基極易與富含不飽和脂肪酸的脊髓組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),繼而損害細胞膜、亞細胞膜,引起膜的通透性異常,導(dǎo)致膜容量調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運功能及ATP生成障礙,引起神經(jīng)細胞壞死。Sekhon[5]等發(fā)現(xiàn),急性脊髓損傷后5 min就產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物,15 min內(nèi)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物已顯著增加,1 h達到最大。由于脊髓神經(jīng)細胞膜含有較多的磷脂和不飽和脂肪酸,自由基的大量產(chǎn)生使脂質(zhì)過氧化在損傷神經(jīng)細胞膜的同時,使磷脂膜上的一些重要酶系統(tǒng),如Na+-K+-ATP酶的活性受到抑制,Na+-K+泵及Ca2+泵失活,導(dǎo)致Ca2+超載。Ca2+超負荷可使線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián),激活磷脂酶A2和C,釋放游離脂肪酸,引起花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng),進一步激活中性蛋白酶,使神經(jīng)微絲、微管和髓鞘蛋白降解,細胞骨架破壞。多種蛋白酶的激活又進一步產(chǎn)生大量FR,使細胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化,廣泛損傷細胞器及膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細胞自溶,形成惡性循環(huán)。而這種惡性循環(huán)不斷加重脊髓的繼發(fā)性損傷。

氧自由基(OFR)是指含有不配對電子的原子、離子、原子團及分子等,因其電子不配對,所以其化學(xué)性質(zhì)非?；钴S,直接測定困難,因此一般測定其降解產(chǎn)物MDA或SOD的活性。MDA可反映過氧化的程度,SOD則反映機體清除氧自由基的能力,二者聯(lián)合測定能間接反映氧自由基的含量及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強度[6]。

MP是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素,具有強烈的抗炎作用。其在靜脈注射約30 min后,脊髓損傷部位出現(xiàn)峰濃度。Hall和Braughle[7-8]通過檢測貓脊髓損傷后脂質(zhì)過氧化物,發(fā)現(xiàn)損傷后脂質(zhì)過氧化物明顯升高,而給予MP治療后,脂質(zhì)過氧化物明顯降低。并發(fā)現(xiàn)MP對脊髓損傷的劑量-效應(yīng)曲線是鐘形的,峰值是30 mg/kg。也就是說,30 mg/kg的MP效果最佳。

MP是一種強有力的抗氧化劑,通過升高脊髓及外周血液中的SOD和降低MDA,抑制脊髓組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng),降低脊髓神經(jīng)的水腫、出血、炎癥等,促進脊髓神經(jīng)的運動、感覺功能的恢復(fù)。同時保護SOD的活性,改善脊髓血流量,穩(wěn)定細胞膜的離子通道和促進鈣離子外移,抑制傷后組織內(nèi)兒茶酚胺的代謝與積聚,提高神經(jīng)的興奮性與傳導(dǎo)性,阻斷氧自由基所介導(dǎo)的一系列病理損害[9]。

本研究結(jié)果顯示,在ASCI后72 h,預(yù)防性使用MP 30 mg/kg及60 mg/kg組SOD明顯升高,MDA明顯降低;而預(yù)防性使用甲基強的松龍的使用時間則影響不大,但以提前30 min使用,效果最明顯。表明預(yù)防使用大劑量MP后,氧自由基清除能力增加,過氧化物產(chǎn)物減少,說明脊髓組織損傷減輕。提示預(yù)防使用大劑量MP可防止氧自由基對脊髓的損傷,改善損傷脊髓的神經(jīng)功能。

本研究結(jié)果顯示,在不同時間預(yù)防性使用不同劑量的 MP,對血清SOD、脊髓損傷段SOD、血清MDA和脊髓損傷段MDA等具有不同的作用?？偟膩碚f,30 mg/kg、60 mg/kg的效果較好,其中又以30 mg/kg效果更明顯;而15 mg/kg的MP預(yù)防性使用則未顯示出神經(jīng)保護作用。顯示在MP預(yù)防性使用時,其對脊髓損傷的劑量-效應(yīng)曲線可能也是鐘形的,峰值也是30 mg/kg。這與大劑量MP的治療作用是一致的。本研究結(jié)果還顯示,MP的使用劑量對脊髓神經(jīng)功能保護的作用有明顯影響,而提前使用的時間影響不大。這可能與本研究所選用的時間間隔太短有關(guān),也可能提示在一定的時間范圍內(nèi),不同時間使用MP對神經(jīng)損傷均有效果。盡管預(yù)防性使用MP的使用時間還需要進一步研究,但本研究也提示30 mg/kg體重的MP在脊髓損傷前30min靜脈推注對脊髓損傷大鼠SOD、MDA效果更好。

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