賁門癌組織中Ebp1 mRNA的表達(dá)及其臨床意義

崔玲玲 李春陽 王旗 馬素好 陳幕華 呂全軍陳萍萍 謝東 李文杰

1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，河南 鄭州450001；2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，河南 鄭州450064

賁門癌組織中Ebp1 mRNA的表達(dá)及其臨床意義

崔玲玲1李春陽1王旗1馬素好2陳幕華1呂全軍1陳萍萍1謝東1李文杰1

1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，河南 鄭州450001；2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，河南 鄭州450064

背景與目的：Ebp1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白質(zhì)，為表皮生長因子受體ErbB-3胞內(nèi)近膜區(qū)結(jié)合蛋白，影響細(xì)胞增殖與分化。本研究旨在探討人賁門癌組織中Ebp1 mRNA表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對120例賁門癌患者的癌組織和癌旁至少5 cm處的正常賁門組織Ebp1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行測定。結(jié)果：73（60.83%）例賁門癌樣本中Ebp1 mRNA表達(dá)下調(diào)，單因素分析顯示，與賁門癌中Ebp1 mRNA的表達(dá)高度相關(guān)的臨床參數(shù)包括年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、家族史、腫瘤體積、病理分級和臨床分期。多因素分析顯示，年齡、家族史、腫瘤體積、病理分級及臨床分期均是Ebp1表達(dá)的保護(hù)因素，而性別是Ebp1 mRNA表達(dá)的危險(xiǎn)因素，即女性中Ebp1 mRNA表達(dá)高于男性。結(jié)論：Ebp1在賁門癌發(fā)展過程中起重要作用，可作為賁門癌病情進(jìn)展的監(jiān)測、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后評估方面的一個(gè)靶基因。

Ebp1； 賁門癌； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Ebp1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白質(zhì)，為表皮生長因子受體ErbB-3胞內(nèi)近膜區(qū)結(jié)合蛋白，是增殖相關(guān)PA2G4家族中的一員，與細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)，參與多個(gè)信號傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞增殖和分化［1］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Ebp1基因在賁門癌原發(fā)灶及其配對的癌旁正常賁門組織（距癌>5 cm）中的mRNA水平及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 樣本采集 選取2005—2006年于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和林州市腫瘤醫(yī)院就醫(yī)的賁門癌患者作為研究對象，得到醫(yī)院和患者同意后，采集手術(shù)后患者賁門癌原發(fā)灶及癌旁>5 cm處正常賁門組織有效標(biāo)本120對。腫瘤標(biāo)本和配對的正常組織標(biāo)本均通過組織學(xué)診斷，以具有賁門癌原發(fā)灶及配對正常賁門組織標(biāo)本作為有效標(biāo)本。標(biāo)本離體后立即放在液氮罐中，后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中冷凍保存。收集患者相關(guān)臨床資料。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Stratagene Mx3000P，Genetimes Technology，Inc.） ；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）；AMV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（美國Promega公司）；熒光定量PCR試劑盒（德國Roche診斷有限公司）。1.3 RNA提取和cDNA合成 使用TRIzol試劑盒從賁門癌標(biāo)本中提取完整的RNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳及RNA的A值評估RNA含量和純度。在紫外光下可見18 S和28 S RNA條帶。用50 μL SuPerscriPt Ⅱ試劑將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的理論基礎(chǔ) 參數(shù)循環(huán)閾值（Cycle threshold），簡稱Ct，是指產(chǎn)生的熒光量超過一個(gè)固定的閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)。通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制，用內(nèi)參基因β-actin對RNA含量的變異進(jìn)行較正?！鱊Ct = （CtNormalEbp1-CtNormalβ-actin），△CCt =（CtCancerEbp1-Ctcancerβ-actin），△△Ct =△NCt-△CCt，以擴(kuò)增倍數(shù)作為結(jié)果，擴(kuò)增倍數(shù)=2△△Ct。

1.5 β-actin、Ebp1引物設(shè)計(jì) 采用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab. 1 Oligonucleotide primer used for real time -PCR

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將cDNA 1∶20稀釋后作為PCR模板，反應(yīng)體積為15 μL，所有的反應(yīng)都在PCR儀上重復(fù)3次，95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，然后72 ℃延伸30 s，84 ℃ 15 s采集熒光，40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃溫度下延伸7 min。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 試驗(yàn)結(jié)果輸入SPSS 12.0軟件，擴(kuò)增倍數(shù)取以2為底對數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，Δ（ΔCt）≥-1定義為陽性，Δ（ΔCt）<-1定義為陰性。采用配對t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 采用Mx3000P軟件分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，整體平行性好，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，熔解曲線產(chǎn)物峰特異（圖1）。

2.2 Ebp1在賁門癌組織中的表達(dá)水平 在120例賁門癌樣品中，Ebp1在73例（60.83%）中 表達(dá)下調(diào)（圖2）。配對t檢驗(yàn)顯示：Ebp1基因的mRNA的表達(dá)在賁門癌組織中與配對的正常賁門組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.534，P=0.000）。

表 2 Ebp1的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 Correlation between the Ebp1 mRNA expression levels and the clinical-pathologic variable(n)

2.3 Ebp1的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的單因素分析 單變量分析顯示：Ebp1 mRNA的表達(dá)與賁門癌的臨床參數(shù)高度相關(guān)，包括年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、家族史、腫瘤體積、病理分級和臨床分期。不同年齡組間Ebp1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.654，P=0.022）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ebp1 mRNA表達(dá)水平顯著低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組（χ2=10.457，P=0.001）；有家族史組Ebp1 mRNA表達(dá)水平顯著低于無家族史組（χ2=28.096，P=0.000）；腫瘤體積越大，病理分級越高，臨床分期越高，則Ebp1 mRNA表達(dá)水平均越低，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.567，P=0.014；χ2=21.690，P=0.000；χ2=14.042，P=0.001）；而性別、浸潤深度和病理類型與Ebp1 mRNA的表達(dá)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.4 Ebp1表達(dá)水平與臨床參數(shù)的多因素分析 將各因素引入非條件Logistic回歸分析模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明：年齡、家族史、腫瘤體積、病理分級和臨床分期均是Ebp1表達(dá)的保護(hù)因素，95%CI分別為0.324（0.140~0.752）、0.032（0.005 ~ 0.193）、0.514（0.274 ~ 0.965）、0.229（0.078~0.669）、0.254（0.097~0.669），即年齡越大，有家族史，病理分級越高，臨床分期越高，則Ebp1 mRNA表達(dá)越低。而性別是Ebp1 mRNA表達(dá)的危險(xiǎn)因素，95%CI為5.113（1.241~21.059），即女性中Ebp1 mRNA表達(dá)比男性高（表3）。

3 討 論

Ebp1是新發(fā)現(xiàn)的一種ErbB-3胞內(nèi)結(jié)合蛋白，ErbB-3是表皮生長因子家族中的重要成員。在外界刺激作用下Ebp1與ErbB-3分離到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)，異位表達(dá)可抑制ErbB-2/ErbB-3陽性表達(dá)的乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞的生長增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化［2-3］。有研究［4-5］發(fā)現(xiàn)Ebp1抑制細(xì)胞增殖的能力與其調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因有關(guān)。也有研究［6］發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca 8113中共表達(dá)ErbB-2/ErbB-3，轉(zhuǎn)染Ebp1基因到該細(xì)胞中，能明顯抑制其生長、分裂和增殖水平，表明腫瘤細(xì)胞在體外的生長增殖受到明顯抑制。還有研究［7］發(fā)現(xiàn)在腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M細(xì)胞中共表達(dá)ErbB-2/ErbB-3，轉(zhuǎn)染Ebp1基因到該細(xì)胞中，細(xì)胞在體外的生長增殖受到明顯抑制。本研究結(jié)果中賁門癌組織中Ebp1基因表達(dá)水平與正常配對賁門組織相比，其表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示Ebp1能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。與上述在細(xì)胞中的結(jié)果相一致。

單因素分析顯示：Ebp1 mRNA的表達(dá)與賁門癌的臨床參數(shù)高度相關(guān)，包括年齡、家族史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積、腫瘤分級和臨床分期。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ebp1的表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)移組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Ebp1表達(dá)水平陰性者比陽性者多，提示Ebp1有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。有研究［7-8］表明，腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M細(xì)胞中共表達(dá)ErbB-2/ErbB-3，轉(zhuǎn)染Ebp1 基因到該細(xì)胞中，細(xì)胞在體外的增殖和生長受到明顯抑制，細(xì)胞周期也發(fā)生變化，侵襲能力減弱，發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力也降低。這與本研究的結(jié)果相吻合。多因素結(jié)果也顯示年齡、家族史、腫瘤體積、病理分級和臨床分期均是Ebp1表達(dá)的保護(hù)因素，與單因素結(jié)果基本一致，但是未顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Ebp1表達(dá)水平的關(guān)系，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Ebp1在賁門組織中的低表達(dá)，與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及腫瘤細(xì)胞的分化不良有關(guān)，可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為賁門癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)預(yù)示指標(biāo)，并可作為一種新的治療腫瘤的基因作用靶點(diǎn)。

表 3 Ebp1表達(dá)水平與臨床參數(shù)的多因素Logistic回歸分析Tab. 3 Multiple factor Logistic regression of Ebp1 mRNA expression levels with clinical-pathologic variable

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Expression of Ebp1 mRNA in human cardiac cancer tissues and its clinical significance

CUI Ling-ling,LI Chun-yang,WANG Qi,MA Su-hao,CHEN Mu-hua,LV Quan-jun,CHEN Ping-ping,XIE Dong,LI Wen-jie(Nutrition and Food Hygiene, College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450001,China)

LI Wen-jie E-mail：lwj@zzu.edu.cn

Background and purpose：Ebp1 is a new type of protein which can interact with cytoplasmic domain of the ErbB-3 receptor and may contribute to transduction growth regulatory signals. This protein has been implicated in growth inhibition and the induction of differentiation of human cancer cells. In this study, we investigated Ebp1 mRNA expression levels and their relations to clinical and pathological features in human cardiac cancer.Methods：We quantified Ebp1 expression levels in 120 cardiac cancer tissues and their matched normal cardiac tissues by using real-time PCR assay.Results：Seventy-three (60.83%) samples showed down-regulation of Ebp1 in cardiac cancer as compared with the matched normal cardiac tissues. The univariate analysis showed that the Ebp1 mRNA expression levels had significant association with age, metastasis, family history, tumor size and TNM stage.The multiple factor analysis showed that age, family history, tumor size, pathological grading and TNM stage were protective factors for Ebp1 in cardiac cancer. But gender was a risk factor because the Ebp1 mRNA levels in females were higher than in males.Conclusion：Ebp1 plays an important role in the procession of cardiac cancer and may serve as a valuable target in monitoring cardiac disease, metastatic potential and prognosis.

Ebp1; cardiac cancer; real-time PCR

R73-35+4

A

1007-3639(2010)04-0265-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30725010)。

李文杰 E-mail:lwj@zzu.edu.cn

2009-09-17

2010-01-08）