HPLC分析桃兒七中鬼臼毒素的含量

熊文勇， 魏朔南， 岳 明

（西北大學(xué)西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710069）

桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying）是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬多年生草本植物，分布于云南、西藏、四川、湖北、陜西、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)［1］，主要生長在海拔2700～4500 m的喜馬拉雅山及附近地區(qū)，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、心胃痛、風(fēng)寒咳嗽、月經(jīng)不調(diào)、解鐵棒錘中毒等。其根和根莖中含有大量的鬼臼毒素及其衍生物，其中鬼臼毒素（podophyllotoxin）具有很高的抗癌活性，是近年來合成抗癌藥物VP－16（etoposide）和VM－26（teniposide）等的前體物質(zhì)［2，3，4］。除此之外，現(xiàn)代研究表明，鬼臼毒素還具有抗病毒、抗免疫、抑菌殺蟲、治療牛皮癬、瘧疾、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥、簇狀禿頭癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化等作用［5］。

近年來的研究表明桃兒七中鬼臼毒素含量較高，可達(dá)1% ～5%［6－9］，文獻(xiàn)報(bào)道了用HPLC法測定桃兒七中鬼臼毒素的含量測定方法，但桃兒七中化學(xué)成分較復(fù)雜［9］，用已有的色譜方法均不能使鬼臼毒素得到很好的分離，本文采用反向高效液相色譜法，參考王曉玲（2003）等對鬼臼毒素提取分離的優(yōu)化工藝［10］，系統(tǒng)地研究了桃兒七中的鬼臼毒素含量HPLC測定方法，克服了文獻(xiàn)報(bào)道中分離度低，峰形不好等缺點(diǎn)，同時(shí)測定了不同產(chǎn)地桃兒七不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量。該法操作簡單，準(zhǔn)確度、靈敏度高，精密度好，易于采用，對于桃兒七質(zhì)量資源的評價(jià)，快速鑒別桃兒七藥材鬼臼毒素含量，提高中藥桃兒七質(zhì)量，保護(hù)瀕危物種具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 日本島津LC－10ATvp高效液相色譜儀，SPD－10Avp檢測器，Class－VP工作站。DL－180超聲波清洗器（浙江海天電子儀器廠），MA200電子天平。

1.2 試劑 鬼臼毒素標(biāo)品（購自陜西藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）均購于天津化學(xué)試劑廠，水為超純凈水，其它試劑均為分析純。

1.3 材料 實(shí)驗(yàn)材料桃兒七樣品分別9月份果熟期采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅舟曲縣插崗、四川馬爾康刷經(jīng)寺、四川康定榆林鄉(xiāng)和云南中甸納帕海地區(qū)。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18（250×4.6 mm，5 μm）;流速:0.5 mL/min;檢測波長:290 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。流動相選擇乙腈（A）－0.04%甲酸水（B），梯度洗脫程序 0～4 min:85%B，4 ～25 min:85－76%B，25～45 min:76% ～75.5%B，45～60 min:75.5%－68%B，60 ～75 min:68%B，75～95 min:68% ～45%B，95～120 min:45%B。

2.2 標(biāo)品溶液配制 精密稱取鬼臼毒素標(biāo)品0.001 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即為標(biāo)品溶液，進(jìn)樣前用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.3 樣品溶液配制 取樣品桃兒七將其粉碎，過40目篩，精密稱取約0.1 g粉末，超聲波振蕩提取3次，每次30 min，加甲醇3 mL，過濾，合并濾液，定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，備用。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取鬼臼毒素標(biāo)品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，進(jìn)樣測定，記錄其高效液相色譜圖譜（圖1），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸直線方程為Y=52 503X+38 464，r2=0.999 4。結(jié)果表明鬼臼毒素在0.2～1.4 μg間具有良好的線性關(guān)系。

圖1 鬼臼毒素對照品色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 取樣品桃兒七粉末，按照“樣品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制成供試溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測得鬼臼毒素峰面積的RSD=0.77%，表明本法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一桃兒七樣品5份，按照“樣品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制成供試溶液，每份進(jìn)樣10 μL，測得鬼臼毒素峰面積的RSD=0.90%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別在0、3、6、9、12、15、24、48 h進(jìn)樣，每次10 μL，記錄峰面積，計(jì)算鬼臼毒素峰面積的RSD=1.97%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取同一已知鬼臼毒素量的樣品0.100 0 g，按照“樣品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制成供試溶液，準(zhǔn)確加入鬼臼毒素對照品0.447 5 mg、0.596 5 mg和0.745 5 mg，每份相同加樣量的樣品制備供試品溶液3份，每份進(jìn)樣10 μL，測定鬼臼毒素的峰面積，計(jì)算平均回收率為99.32%，RSD小于1.61%（見表1）。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.9 樣品測定 桃兒七樣品分別9月份果熟期采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅舟曲縣插崗、四川馬爾康刷經(jīng)寺、四川康定榆林鄉(xiāng)和云南中甸納帕海地區(qū)，涵蓋了除西藏和陜西（2007和2008年均未能采到野生桃兒七）的國內(nèi)所有主要分布區(qū)。精密稱定不同生長地、不同部位桃兒七粉末0.100 0g，按照“樣品溶液的制備”項(xiàng)下的方法制成桃兒七根和莖的供試溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)3次，按上述色譜條件測定，記錄高效液相色譜圖（圖2），以外標(biāo)法計(jì)算桃兒七樣品中鬼臼毒素含量，結(jié)果見表2。

圖2 A.樣品根色譜 B.樣品莖色譜

表2 不同生長地、不同營養(yǎng)器官桃兒七中鬼臼毒素含量（n=3）

3 結(jié)果

3.1 高效液相色譜圖建立 通過本研究，建立了定量分析不同生長地桃兒七不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量的方法及其高效液相色譜圖（圖2:A、B），實(shí)驗(yàn)過程中選擇乙腈－甲酸水（0.04%）為流動相，選擇梯度洗脫的方法記錄色譜圖。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中還對檢測波長進(jìn)行篩選，即選擇在210、260、290 nm處記錄了樣品的高效液相色譜圖，但是由于在210、260 nm處存在強(qiáng)烈背景吸收和基線不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，所以本研究最終確定吸收波長為290 nm。而對于記錄時(shí)間的確立，則是根據(jù)對目標(biāo)成分鬼臼毒素的出峰時(shí)間和整個(gè)樣品出峰情況:鬼臼毒素在95 min出峰，而在120 min后樣品出峰數(shù)目少、峰面積小，且分離效果差，考慮到本研究重點(diǎn)是對鬼臼毒素定量分析，因此最終確立采集時(shí)間為120 min。通過本次研究建立的液相色譜圖，基線穩(wěn)定，分離度好，為進(jìn)一步進(jìn)行桃兒七指紋圖譜分析建立條件。

3.2 含量測定結(jié)果 桃兒七不同生長地、不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量測定結(jié)果顯示（表2），桃兒七不同生長地、不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量均有很大差異，在不同生長地中以寧夏六盤山桃兒七的根中鬼臼毒素含量最高，其次是甘肅興隆山、四川榆林鄉(xiāng)和甘肅插崗、四川刷經(jīng)寺等地區(qū)，而云南納帕海地區(qū)的桃兒七根中鬼臼毒素含量最低。云南納帕海桃兒七的莖中鬼臼毒素含量最高，其次是四川榆林鄉(xiāng)、甘肅興隆山，而四川刷經(jīng)寺最低。在不同營養(yǎng)器官中，桃兒七根中的鬼臼毒素含量均高于莖，而且呈現(xiàn)自北向南含量減少的趨勢;莖中鬼臼毒素含量則沒有明顯的隨地理變化的規(guī)律。除此之外，從總含量上來看，甘肅興隆山桃兒七中鬼臼毒素含量最高，其次是云南納帕海、四川榆林鄉(xiāng)、寧夏六盤山，而四川刷經(jīng)寺最低。

桃兒七不同生長地、不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量變化情況，從表2中可以看出，鬼臼毒素在寧夏六盤山根中含量最高，然而其莖中的含量較低，兩者之間存在的差異性較大;而云南納帕海、甘肅興隆山、四川榆林鄉(xiāng)等地采集的桃兒七，其莖中鬼臼毒素含量較高，與其在根中的含量差異較小。由此可見，從采集樣品桃兒七的生長地來看，鬼臼毒素在桃兒七不同營養(yǎng)器官根和莖中的分布也呈現(xiàn)無規(guī)則變化，沒有一定的相關(guān)性。

4 討論

4.1 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)桃兒七的根及根莖中主要含有木脂素類、黃酮類、皂苷、多糖及鞣質(zhì)等化學(xué)成分。其中有效成分為鬼臼類衍生物，包括鬼臼毒素、去甲鬼臼毒素、鬼臼苦素、去氫鬼臼毒素、鬼臼毒酮、去氧鬼臼毒素、異鬼臼苦酮、4′－去甲鬼臼毒酮、山荷葉素等。桃兒七中的鬼臼毒素以其具有抗癌、抗腫瘤和殺蟲等作用，備受科研工作者的關(guān)注。本研究建立了桃兒七主要化學(xué)成分的高效液相色譜分析方法，以及以鬼臼毒素為指標(biāo)的鬼臼毒素定量分析方法，能很好的把鬼臼毒素與桃兒七中其他鬼臼類衍生物區(qū)分開并進(jìn)行精確定量。該方法定性專屬性強(qiáng)，定量精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可為桃兒七HPLC指紋圖譜研究及種質(zhì)資源評價(jià)建立基礎(chǔ)。

4.2 中草藥化學(xué)成分主要來源于植物的次生代謝產(chǎn)物，對后天生長環(huán)境依賴性很強(qiáng)，故有中藥“道地性”和“最佳采收時(shí)間”之說。陳毓亨（1979年）、王京昆（1995年）等對采收季節(jié)相同但產(chǎn)地不同的桃兒七成分進(jìn)行測定，結(jié)果表明甘肅甘南地區(qū)所產(chǎn)桃兒七中鬼臼毒素的含量明顯高于四川、云南所產(chǎn)的桃兒七［6，7］。馬紹賓等對桃兒七不同采收季節(jié)與鬼臼毒素含量的研究表明，鬼臼毒素在5月份開花時(shí)最高（4.93%），隨著時(shí)間的延伸，含量趨于減少，最低時(shí)在3.0%左右［8］。本研究所用材料采自寧夏六盤山、甘肅興隆山、甘肅插崗、四川刷經(jīng)寺、四川榆林鄉(xiāng)和云南納帕海等不同生長地，其桃兒七不同營養(yǎng)器官中鬼臼毒素含量差異顯著（表2、圖3）。從含量最高的寧夏六盤山所采樣品（根）到含量最低的四川刷經(jīng)寺所采樣品（莖），鬼臼毒素含量的分布都呈現(xiàn)出不規(guī)則性，但就其桃兒七根中鬼臼毒素含量則存在從北向南逐漸減少的趨勢，推測可能北部寒冷高海拔地區(qū)有利于鬼臼毒素的形成積累。有趣的是在云南納帕海采集的樣品中，其莖中鬼臼毒素含量不僅高于本身根中含量，而且還高于其他部分地區(qū)根中的含量。本研究得出的結(jié)果與以上文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，推測其原因可能與當(dāng)?shù)厣L環(huán)境和樣品采集時(shí)間有關(guān)，而具體原因有待進(jìn)一步考察。

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