金蕎麥片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)研究

何美珊， 錢(qián)炳輝， 王兆龍， 王志勇， 閆玉梅

（1.南通精華制藥股份有限公司，江蘇南通 226005;2.上海華氏大藥房有限公司，上海 200082;3.江蘇飛馬藥業(yè)有限公司，江蘇南通 226009）

金蕎麥片為單方浸膏片，是國(guó)家基本藥物、國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有清熱解毒、排膿祛瘀、祛痰止咳平喘的功能，用于急性肺膿瘍、急慢性氣管炎、支氣管哮喘及細(xì)菌性痢疾。金蕎麥片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊(cè)［1］，以薄層色譜法鑒別金蕎麥、紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量。為有效控制金蕎麥片的質(zhì)量，改進(jìn)鑒別與含量測(cè)定方法，薄層色譜主斑點(diǎn)為（-）-表兒茶素、原矢車(chē)菊素B2，用HPLC法測(cè)定（-）-表兒茶素、原矢車(chē)菊素B2的含量。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器 Waters 600E高效液相色譜儀、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、Millennium32色譜管理系統(tǒng)，Varian cary 50 conc紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，sartorius BP211D電子天平，pHS-25型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。SB5200超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司），Model-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海醫(yī)械專(zhuān)機(jī)廠），800型離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。D1810C自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海玻璃儀器公司、上海申科機(jī)械研究所合作出品）。

1.2 試藥與樣品 柱層析用聚酰胺30～60目，批號(hào)F20020709，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司;薄層層析用硅膠G，青島海洋化工廠;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子雙蒸水。

（-）-表兒茶素對(duì)照品，批號(hào)878-200102，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，高效液相色譜歸一化法測(cè)定其含量為98.4%。原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品，批號(hào)Ky020644BB，日本フナュツ株色會(huì)社提供，高效液相色譜歸一化法測(cè)定其含量為95.6%。金蕎麥對(duì)照藥材，批號(hào)1114-200001，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。金蕎麥片供試品，薄膜衣片，南通精華制藥有限公司生產(chǎn)。

2 薄層色譜鑒別

取3.2.2項(xiàng)下供試品溶液5 mL，減壓濃縮至干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺金蕎麥的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照液。另取金蕎麥對(duì)照藥材1 g，加稀乙醇30 mL，置水浴上回流1 h，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至1～2 mL，移置10 mL具塞試管中，加乙腈-水（1∶9）至約10 mL，搖勻，離心（3 000 r/min）5 min，取上清液，照3.3.2項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)下自“加入聚酰胺柱……”起，依法收集洗脫液，減壓濃縮（50～60℃）至干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再?。?）-表兒茶素對(duì)照品、原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品，分別加乙醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1∶2∶0.2∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)7.2 cm，取出，晾干，噴以25%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃加熱約2 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Symmetry C18色譜柱，5 μm，3.9 mm id ×150 mm。流動(dòng)相:水（用磷酸調(diào)pH值至3.00±0.02）-乙腈（92∶8）。流速:0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm，柱溫:35℃，進(jìn)樣量10 μL。色譜柱理論板數(shù)按（-）-表兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 ?。?）-表兒茶素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含（-）-表兒茶素23.9 μg的對(duì)照品溶液。取原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含原矢車(chē)菊素B234.4 μg的對(duì)照品溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取1 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，精密加入乙腈-水（1∶9）25 mL，搖散，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率160 W，頻率50 KHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用乙腈-水（1∶9）補(bǔ)充減失的重量，搖勻，離心（3 000 r/min）5 min，精密量取上清液10 mL，加入聚酰胺柱（30～60目，3 g，內(nèi)徑1.0 cm，濕法裝柱），用水30 mL洗脫，棄去水液，再加乙醇150 mL洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮（50～55℃）至近干，加乙腈-水（1∶9）溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶9）至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺金蕎麥的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸?。?）-表兒茶素對(duì)照品溶液、原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品溶液、金蕎麥片供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

3.3.2 線性關(guān)系考察 取質(zhì)量濃度分別為11.36、22.72、45.44、68.16、90.88、136.32、181.76、227.20 μg/mL的（-）-表兒茶素對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1.190 198×106X+1.475 990 × 103，r=0.999 968。（-）-表兒茶素在0.113 6～2.272 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

取質(zhì)量濃度分別為 16.64、33.28、66.56、99.84、133.12、166.40 μg/mL 的原矢車(chē)菊素 B2對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=9.541 97×105X+5.989 5 ×104，r=0.999 702。原矢車(chē)菊素B2在0.166 4～1.664 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 金蕎麥片HPLC圖

3.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次 10 μL，（-）-表兒茶素峰面積 RSD 為0.76%，原矢車(chē)菊素B2峰面積RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于室溫27 ℃的環(huán)境中放置，在 0、2、4、6、8、24 h，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測(cè)得8 h內(nèi)（-）-表兒茶素、原矢車(chē)菊素B2的RSD分別為0.66%和0.81%，24 h內(nèi)（-）-表兒茶素、原矢車(chē)菊素B2的RSD分別為1.5%和1.67%，試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在本實(shí)驗(yàn)條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定，（-）-表兒茶素含量RSD為0.53%，原矢車(chē)菊素B2含量RSD為0.67%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知（-）-表兒茶素含量為646.06 μg/g金蕎麥片樣品6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，分別精密加入0.623 mg/mL（-）-表兒茶素對(duì)照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，稱(chēng)定重量，搖散，照供試品溶液的制備項(xiàng)下自“超聲處理……”起，依法制備供試品溶液，測(cè)定。（-）-表兒茶素平均加樣回收率為97.12%，RSD為0.92%，見(jiàn)表1。

表1 （-）-表兒茶素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

取已知原矢車(chē)菊素B2含量598.02 μg/g金蕎麥片樣品6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，分別精密加入0.605 mg/mL原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，稱(chēng)定重量，搖散，照供試品溶液的制備項(xiàng)下自“超聲處理……”起，依法制備供試品溶液，測(cè)定。原矢車(chē)菊素B2平均加樣回收率為98.26%，RSD為0.61%，見(jiàn)表2。

表2 原矢車(chē)菊素B2加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.4 樣品測(cè)定 取金蕎麥片5個(gè)批號(hào)樣品，制備供試品溶液;取（-）-表兒茶素對(duì)照品、原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品分別制備對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討論

4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)，分別對(duì)（-）-表兒茶素對(duì)照品溶液、原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，波長(zhǎng)280 nm左右峰形均較好，最大吸收波長(zhǎng)為280.0 nm。

4.2 對(duì)照品與含量測(cè)定成分的選擇 金蕎麥有效成分為原花色素類(lèi)縮合鞣質(zhì)及其前體的混合物［2-4］，包括:（-）-表兒茶素［（-）-epicatechin］及其衍生物的單體、二聚體和多聚體，其中主要有效成分為原矢車(chē)菊素B2（procyanidin B2）。為了有效控制金蕎麥片質(zhì)量，鑒別、測(cè)定有效成分，在金蕎麥片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過(guò)程中使用（-）-表兒茶素、原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品，證實(shí)TLC主斑點(diǎn)、HPLC主要色譜峰均為有效成分，但原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品分離難度大、貨源稀少，本實(shí)驗(yàn)中所用原矢車(chē)菊素B2對(duì)照品的含量偏低（95.6%）。在金蕎麥片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，TLC鑒別使用金蕎麥對(duì)照藥材、HPLC測(cè)定（-）-表兒茶素含量即可。

表3 金蕎麥片供試品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊(cè)［S］.1998:103.

［2］劉永隆，房其年，張秀琴.金蕎麥有效成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1983，18（7）:545-547.

［3］姚榮成，吳友仁，楊崇仁，等.云南產(chǎn)金蕎麥根莖抗腫瘤有效部位的化學(xué)研究［J］.云南植物研究，1989，11（2）:215-218.

［4］張?chǎng)?，李興從，劉玉青，等.威麥寧的酚性成分［J］.云南植物研究，1994，16（4）:354-356.