大孔吸附樹脂對白花泡桐葉中熊果酸的富集研究

余曉暉， 趙 磊， 陳旅翼， 吳定慧， 陳宇紅

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000;2.西北第二民族大學(xué)，寧夏 銀川 750001）

玄參科泡桐屬植物是我國獨(dú)有屬，該屬植物共七種，白花泡桐葉為玄參科（Scrophulariaceae）泡桐屬（Pauline SiebelSuck）植物白花泡桐的葉，是一種常用中草藥，其花、葉、皮、根、果古代就有藥用記載，如《本草綱目》記述:“桐葉……主惡蝕瘡著陰，皮主五痔，殺三蟲?；ㄖ鞲地i瘡，消腫生發(fā)?！保?］近年來研究發(fā)現(xiàn)具有消炎、止咳、利尿、降壓等作用［2］。李曉強(qiáng)等對白花泡桐葉化學(xué)成分研究分離得到包括熊果酸在內(nèi)的8個化合物［3］;陳旅翼等對白花泡桐不同部位的熊果酸含量進(jìn)行測定，其葉中含量可達(dá)11.71 mg/g。［4］熊果酸（ursolic acid）又名烏蘇酸、烏索酸，是廣泛存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，有研究表明熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、降血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)［5］。

大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高，吸附選擇性強(qiáng)，解吸條件溫和，不受無機(jī)物存在的影響;它再生簡便，使用周期長，宜于循環(huán)使用，節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)［6］，近十余年來逐漸應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離和中藥新藥的開發(fā)研制。作為一項(xiàng)提取分離純化的新技術(shù)，有利于解決中藥提取分離中長期以來存在的諸多問題。大孔吸附樹脂用于白花泡桐葉提取分離方面的研究還未見報(bào)道，本文優(yōu)選了5種不同型號大孔吸附樹脂對白花泡桐葉中熊果酸進(jìn)行富集分離研究，為熊果酸富集分離開辟新路。

1 材料與儀器

1.1 材料 甲醇為色譜純，水為二次重蒸餾水，其余試劑均為分析純。熊果酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號742－8902。白花泡桐葉植物樣品2005年采自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院校區(qū)內(nèi)，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室馬志剛教授鑒定為玄參科泡桐屬的白花泡桐（Panlownia Fortunei（seem.））。大孔樹脂購于天津市海光化工有限公司。參數(shù)見表1。

表1 大孔吸附樹脂的技術(shù)參數(shù)

1.2 儀器 高效液相色譜儀（Agilent），Agilent 1100 series泵及檢測器（Agilent 1100化學(xué)工作站），KQ－250TD高頻數(shù)控超聲波清洗器（昆明超聲儀器有限公司），水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 熊果酸的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精確稱取熊果酸對照品5.18 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成含熊果酸0.518 mg/mL的溶液，搖勻即得。

2.1.2 色譜條件的選擇 色譜柱:Hypersil－ODS2柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相:甲醇－水（88∶12），流速0.8 mL/min，檢測波長 220 nm，柱溫 25℃，進(jìn)樣量 10 μL，靈敏度:0.05AUFS。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取對照品溶液 1、3、5、7、9 μL 分別進(jìn)樣，以對照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=169.19X－8.735 3，r=0.999 9。結(jié)果表明:熊果酸在0.518～4.662 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2 大孔吸附樹脂富集熊果酸的工藝考察

2.2.1 上樣液的制備 稱取白花泡桐葉細(xì)粉200 g，以濃度95%乙醇，白花泡桐葉粒徑0.46 mm，液固比11∶1，溫度85 ℃，提取次數(shù)2次，2.5 h/次，合并提取液，減壓回收，50℃真空干燥，得熊果酸粗品。精密稱取熊果酸粗品2 g，加甲醇40 mL溶解，用10%NaoH調(diào)pH=11，抽濾，濾液用10%HCl調(diào)pH=4，再加入等體積的pH=4的酸性水溶液稀釋，靜置20 min，抽濾得沉淀，用甲醇溶解并定容，在

2.1.2項(xiàng)色譜條件下測定，根據(jù)回歸方程得到樣品中熊果酸的濃度為2.322 mg/mL。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理［6］用95%乙醇在室溫條件下浸泡24 h，其間每隔15 min攪拌1次，每次浸泡2 h后濾出乙醇，加入新乙醇，最后用去離子水洗凈;用4%鹽酸室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈;用5%NaOH室溫浸泡3 h，再用去離子水洗凈;用去離子水室溫浸泡24 h，使樹脂充分溶脹備用。

2.2.3 靜態(tài)吸附的測定 取2.2.1項(xiàng)的上樣液5份，50 mL/份，平行3份，分別加入5種預(yù)處理后的樹脂5 g，室溫下放置24 h，適當(dāng)振搖，濾過藥液，蒸餾水洗滌至洗脫液100 mL，按2.1.2項(xiàng)色譜條件測定吸附后溶液中熊果酸的濃度，計(jì)算靜態(tài)飽和吸附量，見表2。

表2 不同樹脂對熊果酸的吸附量比較（n=3）

從表1可以計(jì)算出它們的平均孔徑大小次序AB－8＞D1400＞D101＞DM301＞DA201，該次序與其靜態(tài)吸附量的大小次序一致，表明宜用孔徑較大的樹脂吸附熊果酸。

2.2.4 靜態(tài)解吸的測定 將2.2.3項(xiàng)靜態(tài)吸附飽和的樹脂精密加入50 mL 90%乙醇，放置24 h，適當(dāng)振搖，過濾，蒸餾水洗滌至洗脫液100 mL，定容，按

2.1.2項(xiàng)色譜條件測定并計(jì)算洗脫液濃度。見表3。

表3 不同樹脂解吸所得熊果酸濃度比較（mg/mL）

結(jié)果表明AB－8型大孔樹脂對熊果酸具有較好的吸附作用且易被解吸，故選用AB－8型大孔樹脂進(jìn)一步的研究。

2.2.5 靜態(tài)吸附與解吸溶劑的選擇 取2.2.1項(xiàng)下熊果酸粗品，按2.2.1項(xiàng)下的方法，用60%、70%、80%、90% 乙醇、甲醇配制，用 AB－8樹脂按

2.2.3的方法靜態(tài)吸附并計(jì)算靜態(tài)吸附率;再用60%、70%、80%、90%乙醇、甲醇按2.2.4的方法解吸并計(jì)算靜態(tài)解吸率;見表4。

表4 不同溶劑對熊果酸靜態(tài)吸附量與解吸率

由表可知:AB－8樹脂在60%乙醇中對熊果酸的吸附率最大，而在90%乙醇中的吸附率最小。AB－8樹脂在90%乙醇中對熊果酸的解吸率最大，而在60%乙醇中的解吸率最小。

2.2.6 AB－8樹脂吸附動力學(xué)過程 取5 g AB－8樹脂加入60 mL 2.2.1項(xiàng)的上樣液，于25℃下恒溫振蕩，每隔一段時間取樣，按2.1.2項(xiàng)色譜條件測定熊果酸的濃度。以吸附量對吸附時間作圖，見圖1。

圖1 不同時間熊果酸吸附量圖

結(jié)果表明，樹脂對熊果酸的吸附量隨時間而變化，吸附時間延長，吸附量增加，吸附1 h后，吸附量趨勢減緩，樹脂逐漸達(dá)到飽和吸附量。同時計(jì)算出相應(yīng)時間間隔內(nèi)樹脂對熊果酸的平均吸附速率，再以吸附速率與時間作圖見圖2。樹脂對熊果酸的吸附速率隨時間而變化，0～40 min吸附速率較快，40 min以后吸附速率減緩，50 min以后吸附速率幾乎沒有變化，吸附飽和。

圖2 AB-8樹脂吸附速率曲線

2.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按最優(yōu)化條件:4.1項(xiàng)條件提取，AB－8型樹脂用60%乙醇為吸附溶劑，90%乙醇為解吸溶劑，重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)，結(jié)果熊果酸含量分別為82.30%、84.20%、82.57%，RSD為0.83%。熊果酸回收率分別為86.97%、87.89%、90.22%，RSD為1.37%。

2.2.8 富集程度的考察 白花泡桐葉藥材按4.1項(xiàng)條件提取、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（1）;樣品（1）經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂吸附、解析、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（2）;4.1項(xiàng)條件提取液經(jīng)4.2項(xiàng)方法處理后，經(jīng)AB－8大孔吸附樹脂吸附、解析、回收溶劑、干燥恒重，得樣品（3）。按2.1.2項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算熊果酸經(jīng)上述3種方法處理后的純度和回收率，結(jié)果熊果酸純度含量分別為10.11%、35.68%、83.02%，熊果酸回收率分別為96.51%、90.50%、88.36%。

4 小結(jié)與討論

4.1 上樣液提取工藝篩選 經(jīng)單因素篩選及正交試驗(yàn)，得到上樣液的提取的條件為:以95%乙醇為提取液，泡桐葉粒徑為0.46 mm，液固比11∶1，溫度85℃，提取次數(shù)2次，2.5 h/次，熊果酸的浸出率達(dá)99.28%。

4.2 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中直接以4.1項(xiàng)下乙醇提取液上大孔吸附樹脂，富集熊果酸的吸附較好，但在解吸熊果酸時，雜質(zhì)也隨著解析出來;后經(jīng)單因素考察得到粗品先用10%NaOH調(diào)pH為11，抽濾，濾液用10%HCl調(diào)pH為4，再加入等體積的pH=4的酸性水溶液稀釋，靜置20 min，抽濾，沉淀，重新溶解上AB－8大孔吸附樹脂，得到了純度較高的熊果酸。

4.3 本實(shí)驗(yàn)選擇了5種性能不同的樹脂進(jìn)行研究，以AB－8大孔吸附樹脂富集熊果酸的純度達(dá)83.02%，對分離熊果酸有一定的指導(dǎo)意義。

［1］中國科學(xué)院，中國植物志編輯委員會，中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1976，67（2）:281.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1778.

［3］李曉強(qiáng)，武靜蓮，曹斐華，等.白花泡桐葉的化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2008，31（6）:850－852.

［4］陳旅翼，趙 磊，余曉暉，等.白花泡桐不同部位的熊果酸含量測定［J］.中藥材，2007，30（8）:914－915.

［5］肖坤福，鄭云法，劉成左，等.熊果酸的研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16（12）:.

［6］劉 斌，石任兵，余 超.影響大孔吸附樹脂吸附分離中草藥化學(xué)成分的因素［J］.中草藥，2002，33（5）:475－476.